家蚕非滞育红卵突变体Re-nd突变基因的定位克隆

张海燕, 吴金鑫, 张云贵, 赵 萍, 林 英,*

(1. 四川省农业科学院植物保护研究所, 成都 610066; 2. 家蚕基因组生物学国家重点实验室, 重庆 400716;3. 西南大学生物学研究中心, 重庆 400716)

家蚕Bombyxmori作为遗传背景研究较为深入的鳞翅目模式昆虫，其遗传学研究具有悠久的历史和深厚的积累，而随着家蚕基因组的成功测序和家蚕分子遗传图谱的成功构建，使用定位克隆技术对家蚕突变体进行定位研究成为可能(Mitaetal., 2004; Xiaetal., 2004; Xiaetal., 2008; Yamamotoetal., 2008; Xiaetal., 2009)。 眼色素(ommochromes)作为昆虫色素的主要成分之一，通常以颗粒的形式存在，多与昆虫的表皮、翅、复眼和卵的着色相关，主要表现为黄色、红色、棕色或紫褐色(Linzen, 1974; Sawadaetal., 2000; Bannoetal., 2010)。目前，定位克隆研究方法和技术平台已经相当成熟和完善，已通过定位克隆的方法定位出的家蚕卵色突变体有w-1,w-2,w-3,pe和re等(Quanetal., 2002a, 2002b; Kmotoetal., 2009; Tatematsuetal., 2011; Osanai-Futahashietal., 2012, 2016)，这些突变体的突变基因均与眼色素合成通路相关：白色卵突变体w-1因缺乏犬尿氨酸-3-单加氧酶(kynurenine3-monooxygenase, KMO)导致3-羟基-犬尿氨酸(3-hydroxy-kynurenine)及后续眼色素的合成受阻，从而导致卵色偏白(Quanetal., 2002a, 2007)；白色卵突变体w-2和w-3因white基因的突变导致三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)的功能缺失，不能将眼色素前体转运到色素颗粒进一步形成眼色素， 3-羟基-犬尿氨酸大量富集而呈现淡黄色(鲁成等, 1999; 代方银等, 2000; Quanetal., 2002b; Kmotoetal., 2009; Tatematsuetal., 2011; Xieetal., 2012; Wangetal., 2013; Zhangetal., 2017)；桃红眼白卵突变体pe因cardinal基因的突变而导致吩噁嗪合成酶(phenoxazine synthase)的功能缺失，不能合成眼色素，蚕卵内3-羟基-犬尿氨酸部分发生自身氧化形成少量的眼黄素，导致卵色呈现黄色偏微红色(Osanai-Futahashietal., 2016)；红色卵突变体re由于Bm-re基因的突变导致主要协助超家族转运蛋白(major facilitator superfamily transporter, MFS transporter)的功能缺失，不能合成奥敏类眼色素，仅含有奥马丁(ommatins)类眼色素而呈现红色(Osanai-Futahashietal., 2012; Zhangetal., 2017)。而眼色素生物合成后期3-羟基-犬尿氨酸进一步代谢合成奥马丁类眼色素的过程尚需进一步的研究。由于眼色素及其前体物质易于辨认的颜色，眼色素合成相关基因常被用作分子标记(Klemenzetal., 1987; Fridell and Searles, 1991)。

家蚕非滞育红卵突变体Re-nd是由林英等(2007)利用化学诱变剂N-甲烷-N-甲硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)处理家蚕品种C108而诱导产生的新型非滞育家蚕卵色突变体，而后张宇靖等(2020)证实该突变体属于独立的显性遗传，其突变基因作为分子标记在应用方面潜力极大。同时，张宇靖等(2020)的研究结果暗示非滞育红卵突变体Re-nd的突变基因参与眼色素生物合成后期3-羟基-犬尿氨酸进一步代谢合成奥马丁的过程，而目前对这一过程的研究尚不明确。因此，本研究通过基因连锁分析和定位克隆的方式确定家蚕非滞育红卵突变体Re-nd突变基因所在的染色体位置，为后续Re-nd突变基因的功能研究及应用奠定基础，有助于进一步阐释和完善色素代谢路径，探明非滞育状态下家蚕卵的着色机制。

1 材料与方法

1.1 突变体材料制备

本研究供试的家蚕非滞育红卵突变体Re-nd和野生型家蚕品种大造由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室保存，两个品种第1轮饲养时孵化的催青条件为：温度25℃、光周期12L∶12D，催青周期为10 d左右。饲养至羽化时期，以突变品种Re-nd与野生型品种大造进行杂交产下F1代蚕卵，F1代和大造的蚕卵进行低温催青处理，确保回交产下的BC1代蚕卵为非滞育卵，方便表型判定，蚕卵孵化的催青条件为：温度15℃、光周期6L∶18D，催青周期为30 d左右。由于家蚕具有雌完全连锁、雄个体交换的遗传特性，且张宇靖等(2020)对Re-nd的遗传分析已表明Re-nd属于独立的显性遗传，所以本研究以F1代雌性个体与大造雄性个体回交产生的BC1代个体作为连锁分析的材料；以F1代雄性个体与大造雌性个体回交产生的BC1代个体作为定位克隆研究的材料(图1: A)。在蚕卵非滞育的情况下，在BC1代的蚕卵变为固有色之后进行突变性状的判型，将单个蛾圈的红色卵与淡黄色卵分开并单蛾区饲养(图1: B)，在3龄末期或4龄期收取材料，提取基因组DNA进行实验。所有供试家蚕均在25℃、自然光照的条件下以单蛾区饲养的方式用新鲜桑叶饲养。

图1 基因连锁分析和定位克隆家蚕材料配制模式图Fig. 1 Mode diagram of preparation of Bombyx mori materials for genetic linkage analysis and positional cloningP: 亲本Parents; F1: 杂交F1代The first generation hybrid； BC1: 回交BC1代The first backcrossing generation. F1代的非滞育卵均表现为淡红色； BC1代的非滞育卵出现卵色分离，表现为红色和淡黄色，且比例接近1∶1。红色线框所示用于定位克隆研究的材料；黑色线框所示用于基因连锁分析的材料。The non-diapause eggs of F1 generation were all in light red, while those of BC1 generation showed egg color separation and were in red and light yellow, with the ratio of about 1∶1. Red box indicates the materials for the position cloning, and black box indicates the materials for the genetic linkage analysis.

1.2 SNP标记开发

由于不知道Re-nd的突变基因位于哪一条染色体上，我们针对家蚕全染色体进行单核苷酸多态性标记(SNP标记)开发，每对引物的扩增目的片段长度在500 bp左右，以便测序时一次测通。参照家蚕基因组序列，在家蚕每条染色体上设计6对引物，并以直系亲本P代和F1代的基因组DNA为模板进行PCR扩增和测序筛选。

PCR反应体系(10 μL): rTaq 0.1 μL, 10×rTaq Buffer 1 μL, dNTPs 0.8 μL, 正反向引物(2 pmol/μL)各2 μL， 基因组DNA稀释液4 μL， ddH2O 0.1 μL。PCR反应程序: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 55℃ 15 s, 72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 7 min; 16℃保存。取PCR扩增产物2 μL与2×上样缓冲液混匀，点样至2%琼脂糖凝胶中电泳。选取PCR扩增条带均一的PCR产物适度稀释到10～20 ng/反应后进行产物纯化。产物纯化体系(5 μL体系)：Exonuclease I0.05 μL， SAP 0.05 μL，稀释后PCR产物2 μL，ddH2O 2.9 μL。产物纯化反应程序： 37℃ 30 min； 80℃ 15 min。纯化产物在3730xl基因测序仪上机测序。

运用Sequencher软件对测序结果进行分析，若直系亲本Re-nd与大造测序的序列存在碱基差异，且二者杂交产生的F1代的序列在两个亲本的差异位点为杂合基因型，表现为双峰，兼具两个亲本的基因型，则判定对应的SNP标记可用于后续的连锁分析和定位克隆。每条染色体上筛选到1～2对可用的SNP标记，用于后续的连锁分析和定位克隆。

1.3 连锁分析

由于家蚕的红色卵突变品系re,rec,rel等以及桃红眼白卵pe的突变基因均定位在第5号染色体上(向仲怀, 2005; Osanai-Futahashietal., 2012; Osanai-Futahashietal., 2016)。本研究以第5号染色体上的SNP标记对Re-nd的突变基因进行连锁分析验证：选取24个BC1代连锁分析群体的正常表型个体(卵色表现为淡黄色)和24个突变表型个体(卵色表现为鲜红色)提取基因组DNA并作为模板，以1.2节筛选出的SNP标记进行PCR扩增和纯化测序(同1.2节)。运用Sequencher软件对测序结果进行分析，分析BC1代个体表型与基因型的匹配性：BC1代正常表型(淡黄色卵)个体的基因型与大造的基因型一致，且BC1代突变表型(红色卵)个体的基因型与F1代的基因型一致，则表示突变基因与该SNP标记所在的染色体连锁，反之则为不连锁。

1.4 定位克隆

提取定位克隆群体材料BC1代家蚕幼虫的基因组DNA，针对突变基因连锁的染色体进行SNP标记开发，以筛选出的SNP标记进行PCR扩增和纯化测序(同1.2节)。运用Sequencher软件对测序结果进行分析，在SNP标记位点进行测序结果的记录，分析BC1代个体表型与基因型的匹配性：BC1代正常表型个体的基因型与F1代的基因型一致，或BC1代突变表型个体的基因型与大造的基因型一致，则表示该个体在该SNP标记位点发生了重组。根据重组个体在不同染色体区域SNP位点的测序结果，结合 BC1代重组个体的表型判断突变基因所在的区域：突变基因位于表现为正常表型的重组个体的大造基因型的区域，位于表现为突变表型的重组个体的F1代基因型的区域，二者结合判定突变基因所在的位置。

2 结果

2.1 Re-nd突变基因的连锁分析

连锁分析发现部分BC1代正常表型个体的基因型与大造的基因型不一致，部分BC1代突变表型个体的基因型与F1代的基因型不一致，表明Re-nd突变性状与第5号染色体上的SNP位点的基因型是不连锁的，即Re-nd的突变基因不在第5号染色体上。

以其他27条染色体筛选到的SNP标记对BC1代的连锁群体的基因组进行PCR扩增和纯化测序，发现BC1代的连锁群体的基因型和表型在SNP标记chr.6-2上是完全连锁的，其余26个染色体上的SNP标记基因型呈随机分布，与Re-nd的突变基因无连锁关系。进一步以第6号染色体上的3个SNP标记进行PCR扩增和纯化测序，发现24个BC1代个体的表型与在3个SNP标记上的基因型是一致的，表明突变基因与第6号染色体连锁，即因此可判断Re-nd的突变基因位于第6号染色体上(表1)。

表1 家蚕Re-nd突变基因的连锁分析Table 1 Linkage analysis of the mutant geneof Re-nd of Bombyx mori

2.2 Re-nd突变基因的定位克隆

为了进一步锁定Re-nd在第6号染色体上的位置，针对家蚕第6号染色体开发新的SNP标记，筛选出18个可用的SNP标记(表2)，选用其中相隔一定距离的9个SNP标记对48个BC1代定位群体的突变表型个体基因组进行PCR扩增和纯化测序，将Re-nd的突变基因定位在SNP7和SNP17两个SNP标记之间，剩余重组个体5个；扩大样本群体，在384个BC1代定位群体中筛到在SNP7和SNP17之间发生重组的重组个体20个，以SNP7和SNP17之间筛选出的6个SNP标记对这25个重组个体进行精细定位，测序后将定位区域缩小到SNP10和SNP12两个SNP标记之间，位于nscaf2853上，物理距离949.3 kb左右(图2)。

表2 家蚕第6号染色体上的SNP标记Table 2 SNP markers on chromosome 6 of Bombyx mori

图2 家蚕Re-nd突变基因的定位克隆Fig. 2 Positional cloning of the mutant gene of Re-nd of Bombyx mori初步定位克隆结果显示Re-nd的突变基因位于SNP标记SNP7和SNP17之间，物理距离4.04 Mb；精细定位克隆结果显示Re-nd的突变基因所在的区域位于SNP10和SNP12两个SNP标记之间的nscaf2853上，物理距离949.3 kb左右。The preliminary positional cloning results showed that the mutant gene of Re-nd was located between the SNP markers SNP7 and SNP17, with a physical distance of 4.04 Mb. The fine positional cloning results showed that the region of the mutant gene of Re-nd was located on nscaf2853 between the SNP markers SNP10 and SNP12, with a physical distance of about 949.3 kb.

2.3 定位区域内候选基因信息分析

根据最新版本家蚕基因组数据库(SilkDB 3.0)的信息，在精细定位获得的区域内包含50个候选基因，其中非特征蛋白编码基因6个，具有FLYWCH锌指结构域的基因8个，Fes/CIP4和EFC/F-BAR同源域基因3个，未注释基因8个，其他不同的功能基因28个，已有的基因信息较为复杂多样，不容易确定候选基因，还需进一步精细定位缩小候选区域，减少候选基因数量后再进行详细的信息分析和验证。

3 讨论

家蚕卵色突变基因可作为分子标记用于转基因筛选，白色卵突变体(w-1,w-2和w-3)和桃红眼白卵突变体(pe)由于其卵色为淡黄色，易与非滞育卵和未受精卵相混淆而应用受限 (Quanetal., 2002a, 2002b; Tatematsuetal., 2011; Osanai-Futahashietal., 2016)；红卵突变体re卵色鲜明，但属于隐性突变体，不利于筛选转基因杂合子(Osanai-Futahashietal., 2012)；家蚕非滞育红卵突变体Re-nd是由林英等(2007)利用化学诱变剂MNU处理家蚕品种C108而诱导产生的突变体，属于浆膜色突变，通过与野生型品种大造和N4的遗传杂交分析被证实属于独立的显性遗传(张宇靖等, 2020)，相对于其他卵色突变体，其卵色鲜明且为显性性状，易于筛选转基因杂合子，其突变基因作为分子标记在应用方面潜力极大。

张宇靖等(2020)通过对Re-nd与其他已知突变基因的卵色突变品种的遗传杂交分析，推测Re-nd的突变基因位于眼色素合成通路中w-2及pe突变基因所处位置的下游，参与眼色素生物合成后期3-羟基-犬尿氨酸进一步代谢合成奥马丁的过程，而目前对这一过程的研究尚不明确，且目前对家蚕卵色眼色素生物合成代谢的研究均是在滞育的前提下进行的(Osanai-Futahashietal., 2012, 2016; Zhangetal., 2017)，非滞育状态下的研究尚未有相关报道。

本研究以家蚕非滞育红卵突变体Re-nd为研究对象，根据家蚕的遗传特性，与野生型品种大造进行杂交和回交，配制连锁分析和定位克隆的群体材料，通过连锁分析和定位克隆，将家蚕非滞育红卵突变体Re-nd的突变基因定位到第6号染色体的nscaf2853上，位于两个SNP标记SNP10和SNP12之间，物理距离949.3 kb左右(图2)，为后续Re-nd突变基因的精细定位及功能应用研究奠定基础，有助于进一步阐释和完善色素代谢通路，探明非滞育状态下家蚕卵的着色机制。