高效反硝化细菌驯化培养及其包埋填料低温条件下应用性能研究

＊周亚坤

（北京市市政工程设计研究总院有限公司 北京 100082）

氮的高效稳定去除仍是目前污水处理领域热点问题之一[1-3]，大多数污水厂目前采用活性污泥法处理污水[4]，其反硝化处理能力虽基本满足要求，但仍存在着较大的提升空间[5]，尤其在冬季低温条件下污水厂的反硝化脱氮效果较差。经研究发现，通过有效反硝化细菌数量的增加来提高反硝化效率是有效的技术途径[6-8]。因此快速驯化培养出高效反硝化脱氮菌群，并利用包埋固定化技术[9]将其制作成生物活性填料，投放到反硝化功能池中，可以有效提高反硝化菌群的数量及活性[10]，从而提高污水处理厂冬季低温条件下的脱氮能力。

目前已有针对高效反硝化细菌驯化培养的研究，多为特定功能菌属的纯菌扩增培养，菌种较为单一，抵抗外界环境条件的稳定性不高。有研究通过序批式实验已驯化出反硝化速率为300mg·(L·h)-1的高效反硝化细菌[11]，但对于细菌的驯化机理及脱氮性能的进一步提高仍需研究。有研究者系统地阐述了活性污泥的驯化机理[12-14]，但针对驯化成熟的高效菌应用性能未作研究。对于包埋反硝化填料的研究，多局限于实验室配水条件下，应用于实际污水的脱氮性能研究较少。有学者将反硝化填料应用于二级出水脱氮的研究[15]，但其所用菌源未经驯化培养，填料的脱氮性能较为低下。

本文实验以具有较高生物多样性的活性污泥为菌源，以具有底物多样性特点的乙酸钠作为碳源，采用流加-间歇式培养方法（连续进药，间歇排水），梯度提高硝酸盐负荷[16]，对反硝化细菌进行驯化培养，得到了高效稳定的广谱性反硝化脱氮菌群[17]，通过细菌固定化技术制作成包埋反硝化填料[18]，在冬季低温条件下对不同浓度的市政污水表现出了良好的脱氮性能。

1.材料与方法

(1)实验水质及分析方法

以北京某污水处理厂二沉池回流污泥为菌源，实验用水为人工模拟硝酸盐废水，硝酸钾提供氮源，乙酸钠提供碳源，KH2PO4提供反硝化细菌所需要的磷，氮源和碳源的投加量随反硝化速率的增加而提高，同时每升进水中加1.25mL微量元素[19]，微量元素的组成如表1所示。

表1 微量元素组成表

依据标准分析法[20]测定NO2--N、NO3--N、COD、污泥浓度（MLSS）、温度（T）、pH，其中NO2--N、NO3--N分别采用N-（1-萘基）乙二胺光度法和紫外分光光度法（UV-1600PC，MAPADA），COD值采用连华科技快速测定法，MLSS采用滤纸烘干称重法测定，温度使用温控器探头测定，pH利用在线仪表监测。

(2)流加-间歇式培养方法的建立

反应器主体为304不锈钢水箱，总体积为200L，配有一台双桨搅拌装置（转速范围：0～250r/min可调），pH探头连接自控装置，通过控制蠕动泵向反应器内投加稀硫酸（pH：3.5±0.5），调节反应体系酸碱平衡，加热环连接温控装置维持反应器内温度恒定。

实验采用流加-间歇的运行模式，即连续进药，周期结束后将上清液排出。每个运行周期为10h，其中流加进水周期为8h，静置排出上清液时间为2h。以出水TN（NO3-和NO2-）浓度接近零为指示标准，逐步提高进水的NO3--N浓度，从而刺激反硝化细菌的生长。流加-间歇的培养方式，可有效解决反硝化过程中因污泥上浮而引起的细菌流失问题，同时还可以控制反应器内的COD浓度，阻止其他异养菌抢夺反硝化所需碳源，并实现其他异养菌、硫酸盐还原菌、水解酸化细菌等的大量生长，控制反应器内温度在26±1℃，利用pH探头连接自控装置控制反应器内pH为7.4±1，连续运行反应器至单位质量污泥的反硝化速率趋于动态平衡，连续运行34d。

(3)微生物菌群结构分析

通过高通量测序手段对不同驯化阶段的污泥样品进行菌群结构检测分析，实验共选取3个样品，每个样品的选取时间如表2所示。

表2 各样品选取情况统计

利用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit从样本中提取DNA，针对细菌16SrRNA的V3-V4区基因进行PCR扩增测序，引物设计为V3-V4通用引物：341F引物（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG）和805R引物（GACTGGAGTTCCTTGGCAC CCGAGAATTCCA），共进行两轮扩增。PCR扩增结束后，利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，然后通过Illumina Hiseq2500 PE250平台进行高通量测序，测序数据利用 MEGAN 软件进行环境微生物的16S分析，可分别得到每个样本对应的优质序列，根据序列之间的相似性，将各序列分成不同的聚类操作分类单元（OTUs），最后对OTUs结果进行分析计算。

(4)包埋反硝化填料应用性能研究

为有效提高冬季低温条件下（9～11℃），污水厂反硝化过程的脱氮性能，利用细菌包埋技术，将驯化成熟的高效反硝化细菌制作成包埋填料，考察其在冬季低温条件下对于市政污水中TN（NO3-和NO2-）的去除能力。实验以北方某污水处理厂二级出水为原水，其TN浓度约为25mg·L-1，通过连续流反应装置研究包埋反硝化填料在冬季低温条件下的脱氮能力。

2.结果与讨论

(1)广谱性高效反硝化细菌的驯化培养

①反硝化速率与进水NO3-浓度变化关系

从图1可以看出随着进水NO3-浓度不断增大，反硝化速率呈现不断上升的趋势。培养初期，由于污泥体系中异养菌较为丰富，与反硝化细菌存在碳源的竞争，故反硝化速率增长较为缓慢。从第8d开始反硝化速率增长速度明显加快，呈现对数增长趋势，这说明反硝化细菌的菌群优势逐步建立，经过34d的培养，反硝化速率最终达到了546.34mg·(L·h)-1，并趋于稳定，此时反应体系中反硝化细菌的生长代谢形成动态平衡，反硝化细菌菌群优势形成。流加-间歇式培养反硝化细菌，NO3-与COD同时加入反应器，有效控制了反应体系中的COD浓度，从而抑制了其他异样菌的生殖，保证了污泥体系的稳定。

图1 反硝化速率与进水NO3-负荷、出水TN之间的关系

②污泥浓度与比反硝化速率变化分析

从图2可以看出前4d污泥浓度的增长较为缓慢，这是由于培养启动阶段体系中的好氧型细菌消亡所致，从第5d开始MLSS增长率有了明显提升，同时比反硝化速率（单位质量污泥反硝化速率）也开始明显提高，这表明反硝化细菌开始逐步适应驯化条件，并在菌群结构中逐渐占据一定优势，比反硝化速率最高可达到60.66mg·(g·h)-1，这表明驯化成熟的污泥体系不仅反硝化功能菌的数量得到了扩增，单位质量污泥的脱氮性能也得到了增强。

图2 污泥浓度与比反硝化速率变化关系

③微生物群落结构多样性变化分析

微生物结构多样性变化是活性污泥体系对驯化条件做出的进一步调整，通过高通量测序可有效反应不同培养阶段微生物多样性的变化。表3为样品多样性指数统计表，本研究共选取了3个样品，所有样本的Coverage指数均在0.93以上，这表明测序比较全面的覆盖了所有物种，保证了测序的有效性。

表3 不同阶段微生物多样性统计

如表3所示，通过测序从3个样本中得到了61740、38239、71166条优质序列，分别被分为了6216、1496、4465个OTUs（操作分类单元）。Shannon指数可有效反应样本中微生物的多样性，Shannon值越大，说明群落多样性越高。Sample0到ZYK-4，样本的Shannon指数从6.49降低到了2.61，这说明原始污泥具有较大的微生物菌群多样性，随着进水负荷的不断提高，污泥体系的多样性呈现出递减趋势，这表明高硝酸盐浓度的水质条件对微生物菌属进行选择，同时微生物菌群为适应驯化条件而不断做出适应性调整。其中反硝化菌群能够适应并生存下来，不适应的菌属受到抑制或被淘汰出污泥体系。从微观层面来看，高效反硝化细菌的驯化过程，即为驯化条件对污泥中微生物菌群进行选择的过程。

④微生物菌群结构变化分析反硝化菌属种类十分繁多，已有50多个属和130多个种被报道[22-23]。反硝化功能菌群结构变化是活性污泥驯化更高一级的适应性调整，表4统计了各样品中微生物在属分类水平上的丰度变化情况，可以明显看出在驯化条件的影响下，微生物菌群结构发生了明显的适应性变化。

表4 不同培养阶段微生物优势菌属统计

其中丰度变化明显的Thauera和Pseudomonas，两者均为污水处理中较为常见的反硝化菌属[24]，且在培养过程中丰度较高。Thauera是Betaproteobacteria纲下的一类具有反硝化能力的革兰氏阴性细菌，且具有降解多种芳香族污染物能力，Paracoccus菌属已被Baker S C正式描述为反硝化副球菌属[25]，属内存在异养硝化型细菌分支，说明了污泥体系具备一定的氨氮去除能力。

如表4所示，原始污泥样本中反硝化主要功能菌属Thauera丰度仅为2.85%，经过驯化培养，两种反硝化功能菌属Thauera和Pseudomonas分别达到了26.87%和42.99%，扩大了近25倍，成为了污泥中的绝对优势菌群，同时具有反硝化功能的菌群多样性得到了提升，如具有反硝化功能的Paracoccus（12.58%）较活性污泥也有了明显提升。如图3所示，反硝化同功菌群的结构也在不断的发生变化，随着驯化浓度的提高，Thauera最终取代Pseudomonas成为菌群中的优势菌属。由此可以看出通过驯化培养，污泥体系中具有反硝化功能的菌群结构发生了明显变化，但反硝化功能菌群的丰富有了明显的提升，这也是污泥反硝化性能保持高效且稳定的原因。

图3 不同培养阶段微生物群落结构变化（属水平）分析

(2)低温条件下包埋反硝化细菌填料应用性能分析

冬季低温条件下污水厂生物脱氮单元普遍存在细菌活性较差，脱氮性能不高等问题，为考察驯化成熟的反硝化细菌对低温条件下市政污水的实际脱氮效果，将驯化后的污泥离心浓缩至含水率为85%，将其与质量分数为15%的PVA凝胶混合成包埋液，将包埋液均匀涂装在圆柱形条状载体上，在过饱和的硼酸溶液中交联，最后切成1cm长度的筒状填料，分装于悬浮填料球中。

①对低氮浓度市政污水的脱氮性能分析

由图4可以看出，冬季低温条件下污水厂二级出水中约含有25mg·L-1的TN，在运行前初期包埋反硝化填料对TN的去除率增长较为缓慢，从第5d开始填料开始逐步适应二级出水水质，对TN的去除率表现出较快的增长，经17d左右的运行，出水TN可降至5mg·L-1以下。运行过程中，填料对二级出水中COD的利用率最高可达67.51%，这有效降低了深度处理单元碳源的投加量。由此不难看出，对于低氮浓度的二级出水，包埋反硝化填料能够保持良好的脱氮性能，这对于强化污水厂二级出水的脱氮效果具有重要意义。

图4 包埋反硝化填料强化二级出水脱氮性能分析

3.结论

以污水厂回流污泥为菌源，通过流加-间歇的培养方式梯度提高硝酸盐负荷，得到了去除速率为546.34mg·(L·h)-1的高效反硝化脱氮菌群。

高通量测序研究发现驯化条件使原始活性污泥多样性显著降低，但丰富了反硝化同功菌群结构的多样性，其中Thauera和Pseudomonas变化较为明显，丰度由2.85%达到了69.86%，最终形成了同具反硝化功能但种类不尽相同的广谱性反硝化菌群，与驯化条件形成了新的动态平衡，这为细菌及填料高效稳定的脱氮性能奠定了基础。

冬季低温条件下，包埋反硝化填料可使污水厂二级出水TN稳定在5mg·L-1以下，这对提升污水厂冬季对于市政污水的脱氮能力具有重要的参考意义。