猪圆环病毒病基因工程疫苗研究进展

高艳飞，王尚辉，王海伟，孙明霞，潘 力，肖培宇，蔡雪辉，涂亚斌

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD）在全球范围内广泛流行，各生长阶段的猪均易发该病，因其致病性高、传染性强、能够引起严重的免疫抑制等特点，严重阻滞了全球养猪业的健康发展。猪圆环病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是导致PCVD 的主要病原，其对环境的耐受力强，对氯仿不敏感，在56 ℃或70 ℃均能够存活一段时间。PCV2 无血凝性，其遗传物质为单股负链、共价闭合的环状DNA[1-2]。PCV2 的环状DNA 中存在开放阅读框ORF2，其编码的衣壳（Cap）蛋白是PCV2 主要的保护性抗原[3]，也是基因工程疫苗研究的主要靶蛋白。目前已发现PCV2 的8 个基因亚型， 分别为PCV2a～PCV2h[4]。PCV2a、PCV2b、PCV2d 是PCV2 的3 种主要基因亚型，其中PCV2d 的致病性较强[5-6]。

目前防控该病的主要策略是合理接种疫苗，然而商品化的疫苗多为灭活疫苗，存在免疫效果差、免疫次数多、生产成本高、研发周期长、免疫保护期短等缺陷，且研究表明当前PCV2 变异迅速[7]，这些问题给PCVD 的防控带来了严峻的挑战，而经济、安全、稳定和制备快速的基因工程疫苗是当前PCVD疫苗研究的热点，其能够规避灭活疫苗的部分缺点，为更好地防控PCVD 提供了可能，但仍然存在一些问题及不足。本文概述了PCVD 基因工程疫苗的种类、优缺点及相关研究进展等，旨在为该病基因工程疫苗的研发积累参考资料，为高效PCVD 基因工程疫苗的研发提供思路。

基因工程疫苗是利用DNA 重组技术，于细菌、酵母菌或哺乳动物细胞等中定向插入人工合成的或天然的目的基因，使之充分表达，并经一系列工艺操作后制备的疫苗或利用基因工程技术敲除病原的相关毒力基因后制备而成。利用基因工程技术能够研制出亚单位疫苗、基因缺失疫苗、嵌合病毒疫苗、DNA 疫苗、活载体疫苗、标记疫苗等。表1 为目前主要的商品化PCVD 基因工程疫苗的类型。

表1 目前主要的商品化PCVD基因工程疫苗的类型

1 亚单位疫苗

亚单位疫苗是将病原的免疫保护性相关基因克隆到合适的表达载体中，在体外高效表达保护性抗原，经过一系列工艺处理后，获得的一种疫苗[8]。上世纪80 年代为了防控乙型肝炎，科学家们利用基因重组技术，在其他生物中首次成功表达了乙肝疫苗抗原—HBsAg，使得乙肝疫苗能够规模化生产，对乙型肝炎的防控起到了关键性作用。后来有研究者利用基因工程技术成功研制出了PCVD 亚单位疫苗，目前PCVD 亚单位疫苗包括常规亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。

1.1 常规亚单位疫苗 常规亚单位疫苗常用的表达系统包括：杆状病毒/昆虫细胞表达系统、大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统。YE 等构建了PCV2 的BV-GD-ORF2 的杆状病毒双表达系统，该表达系统能够同时表达PCV2 的Cap 蛋白和疱疹性口腔炎病毒的糖蛋白（VSV-G），动物实验表明该重组杆状病毒接种后能够诱导小鼠产生高水平的细胞和体液免疫反应[9]。Kim 等利用杆状病毒（Bac）表达系统分别表达PCV-2b、PCV-2d 的Cap 蛋白，动物实验发现表达的两种Cap 蛋白均能有效保护目标动物[10]。常规亚单位疫苗仅有病毒的部分结构蛋白，安全性高，但常规亚单位疫苗的抗原性与所选用的表达系统相关，因此选择合适的表达系统是制备该类疫苗的关键。

1.2 病毒颗粒样疫苗 病毒样颗粒（Virus-like particles，VLP）疫苗是一种新型亚单位疫苗，其仅有病毒的外壳蛋白而不含病毒遗传物质，且形态结构与天然病毒粒子相似，能够诱导机体强烈的免疫反应[11]。迄今已有多种PCV2-VLP 疫苗被报道，根据表达系统的不同，可分为大肠杆菌表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统、酵母表达系统、植物表达系统。

1.2.1 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌作为最早用于表达外源蛋白的表达系统，具有生长迅速、表达量大、遗传背景清晰、操作简单等优点，是规模化制备结构简单，且不需要额外修饰的重组蛋白的首选表达系统[12]，但大肠杆菌表达的外源蛋白，需要去除内毒素，会造成目的蛋白的损失。Wu 等优化了Cap 基因5'端带有稀有精氨酸的密码子，使其在大肠杆菌中能表达出自组装成VLP 的全长重组蛋白（CAP1-233），实验证明该VLP 能够诱导小鼠产生针对PCV2 的特异性免疫应答[13]。Xi 等部分优化了Cap蛋白的密码子，将其定向插入表达载体中，并转化入大肠杆菌后，能够大量表达Cap 蛋白，且此Cap 蛋白能在中性缓冲液中自组装成VLP，免疫猪后证明其具有很好的免疫原性，是一种候选亚单位疫苗[14]。

1.2.2 杆状病毒/昆虫细胞表达系统 与大肠杆菌表达系统相比，杆状病毒表达系统以糖基化、磷酸化等方式修饰外源蛋白，使表达的重组蛋白具有与天然病毒蛋白类似的结构和活性，且有利于形成VLP，但相比于大肠杆菌表达系统，杆状病毒表达系统表达蛋白的成本高。He 等分别在大肠杆菌BL21 原核表达系统和杆状病毒感染的家蚕中表达带有6×His 标签的Cap 蛋白，发现家蚕幼虫表达的Cap 蛋白在体外能够自组装成VLP，并且于透射电镜（TEM）下观察到了VLP，动物实验发现家蚕幼虫表达的VLP 具有良好的免疫原性，具备开发成为高效疫苗的潜力[15]。Masuda 等利用蚕-杆状病毒表达系统大规模表达了PCV2-VLP，并成功建立了三步法分离纯化重组衣壳蛋白（rCap）的简单方法，纯化的rCap 自组装成与原病毒形态相似的VLP，且生产的VLP 能够诱导小鼠产生PCV2 的中和抗体[16]。

1.2.3 酵母表达系统 酵母生长迅速、能够大规模发酵，其既具有原核表达系统的优点，又具有一定的修饰和翻译后加工蛋白的能力，且该表达系统能够将目的蛋白分泌到细胞外，但是其分泌效率低。Duan等利用马克斯克鲁维酵母表达出能组装成VLP 的Cap蛋白，动物实验发现其能诱导小鼠产生高效价的IgG，并且降低了小鼠肝脏和脾脏中的病毒滴度[17]。Chen等利用酿酒酵母表达出大量可溶性的分泌于培养基中的Cap 蛋白，且能自组装成VLP，表达产量较高，能够作为PCVD 亚单位口服疫苗的候选疫苗[18]。

1.2.4 植物表达系统 目前已有多种植物能够表达外源蛋白，包括烟草、大豆、水稻、玉米等。相比于其他表达系统，植物表达系统具有安全性高、生产成本低、表达的外源蛋白易于储存和加工等优点，且能够正确翻译和修饰外源蛋白，但植物表达系统存在表达量低、免疫原性弱等诸多问题。Park 等利用植物表达系统表达了PCV2 重组Cap 蛋白，并利用亲和层析法纯化后，经透射电镜观察发现其在pH 值为中性时自组装成了VLP，豚鼠实验证明该VLP 能诱导动物产生特异性免疫应答[19]。

VLP 疫苗与单一病毒抗原蛋白及多肽相比，其构象表位类似于天然病毒的构象表位，免疫原性良好，且不含病毒基因组，是安全高效的基因工程疫苗，但VLP 疫苗需要综合考虑上游基因的构建、表达系统的选择、纯化放大工艺的优化及VLP 质量鉴定的方法等因素。

1.3 嵌合病毒样颗粒疫苗 嵌合病毒样颗粒（Chimeric virus-like particles，cVLP）疫苗是将外源性抗原多肽利用化学方法偶联VLP 或通过融合基因表达制备而成，是一种改良型的VLP[20-21]。cVLP 疫苗的应用前景良好，迄今已有多种cVLP 疫苗被报道。PCVD 的cVLP 疫苗主要包括嵌合T 细胞表位的PCV2-VLP 和嵌合B 细胞表位的PCV2-VLP。嵌合通用T 细胞表位的PCV2-VLP 是利用基因工程技术于PCV2 的VLP 上表达多个T 细胞通用表位，其能够增强机体针对PCV2-VLP 的细胞免疫，从而减少佐剂的使用甚至替代佐剂，目前暂无文献报道嵌合通用T细胞表位的PCV2-VLP。嵌合B 细胞表位的PCV2-VLP 是将其他病原的B 细胞表位嵌合于PCV2-VLP中，使其能够有效刺激机体产生针对多种病原的特异性免疫应答，目前已有文献报道了嵌合猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）和口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）B 细胞表位的PCV2-VLP[22-23]，该类cVLP 疫苗能够实现一针多防，减少动物的免疫应激，且节省人力物力。但需要注意的是高效免疫表位和表达载体的选择是cVLP 疫苗设计的关键，也是其设计的最大障碍。

亚单位疫苗不含病原感染性物质，其能够避免弱毒疫苗毒力返强、灭活疫苗灭活不完全等的潜在风险，为开发出新型PCV2 疫苗提供了思路，但目前商品化的PCV2 亚单位疫苗大多由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达，尽管Cap 蛋白在该表达系统中能够自组装成VLP，且免疫原性良好，但利用该表达系统生产VLP 的效率低、成本高。因此为了克服杆状病毒表达系统的不足，实现VLP 疫苗的高效规模化生产，本实验室利用大肠杆菌表达系统研制出低成本、高产量、高纯度和高密度的PCV2-VLP 疫苗，并且建立了高效去除内毒素和PCV2-VLP 质量控制的方法，免疫猪后的攻毒保护实验结果显示该疫苗能够有效保护猪免受野毒的攻击，目前该产品已接近商品化，对于防控PCVD 意义重大，图1 为本实验室规模化制备的PCV2-VLP 电镜照片。

图1 PCV2-VLP原液与PCV2-VLP原液稀释20倍

2 PCV1/2 嵌合病毒疫苗

嵌合病毒疫苗是指通过改造病原体的基因组，即以不同的形式置换或连接两种或多种病原体的基因组或片段，构建出表达不同病原的重组基因，通过一些操作后，制备成传统疫苗或基因工程疫苗。有研究者利用PCV1 的ORF2 基因置换PCV2 的ORF2基因，构建出嵌合的PCV1/2 病毒株，经处理后制成PCV1/2 嵌合病毒疫苗。该嵌合疫苗包括嵌合病毒弱毒苗和嵌合病毒灭活苗。Liu 等向缺失PCV1 ORF2 的pSKk-PCV1ΔORF2 中插入PCV2 ORF2，动物实验发现免疫组14 d 后，就有部分小鼠产生了PCV-2 Cap蛋白的中和抗体，表明该嵌合病毒能够诱导小鼠产生特异性的抗体[24]。Li 等评价了2b 和2d 两种基因亚型的嵌合病毒灭活苗的免疫效果，证实了这两种嵌合病毒灭活苗均能够对猪提供相应的免疫保护[25]。Hemann 等评价了PCV1/2 嵌合病毒灭活苗和减毒活疫苗的免疫保护效果，结果表明两种疫苗均能够降低育龄动物的病毒血症水平，但两种疫苗均不能阻止病毒的垂直传播[26]。

PCV1/2 嵌合病毒活疫苗能够同时诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，但存在疫苗毒力返强的风险，PCV1/2 嵌合病毒灭活苗安全性和免疫效果均较好，但存在灭活不彻底的潜在风险，且生产过程复杂，成本高。尽管目前已有商品化的PCV1/2 嵌合病毒灭活苗，但由于其价格昂贵，不利于PCVD 的防控。

3 DNA 疫苗

DNA 疫苗是将病原的相关抗原基因克隆至真核表达质粒中，构建出重组质粒，将其注射动物体后，表达出专一性的抗原蛋白，诱导机体产生针对相应抗原的特异性体液免疫和细胞免疫应答[27]。最早的DNA 疫苗是编码流感病毒抗原蛋白的DNA质粒，该质粒能够保护小鼠免受流感病毒的攻击。单继艳等将H7N9 亚型禽流感病毒HA 基因的质粒免疫鸡，攻毒保护实验结果表明该质粒能够保护鸡免受流感病毒的侵袭[28]。后续有研究者设计了能够表达Cap 蛋白的质粒，Fu 等构建了在293T 细胞中高效表达的质粒PCV2-Cap 和PCV2-Ub-Cap，小鼠实验证明PCV2-Ub-Cap 的免疫效果优于PCV2-Cap[29]。Syllas 等利用构建的DNA 疫苗pEGFP-Cap 免疫小鼠，结果显示，与未免疫组相比，免疫组小鼠的病毒载量明显降低，且临床症状和病理变化均明显减轻[30]。

DNA 疫苗的免疫保护期长、能够诱导机体的细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）应答，且易于构建，然而DNA 疫苗的免疫效果与其入核的效率密切相关，因此需要选择合适的递送载体，以提高DNA 疫苗的递送效率，进而增强DNA 疫苗的免疫效果，然而DNA疫苗存在与体内基因组整合的潜在风险和免疫后可能引发免疫耐受等诸多问题难以解决[31]，所以PCV2的DNA 疫苗尚处于实验室研发阶段。

4 活载体疫苗

利用基因工程技术将病原抗原基因插入活载体中构建的疫苗为活载体疫苗，根据重组载体的不同，主要包括重组细菌活载体疫苗和重组病毒活载体疫苗两大类[32-33]。活载体疫苗最早是以痘病毒为活载体研发出来的基因工程疫苗，痘病毒基因组大，对插入外源性基因的耐受力强，能够同时插入多个外源基因，且表达水平高，具有开发成为多联疫苗的潜力。活载体疫苗自问世以来备受研究者的青睐，迄今已有多种PCV2 活载体疫苗被报道。

4.1 重组细菌活载体疫苗 Zhang 等构建了一种可以口服的重组枯草芽孢杆菌的PCV2 疫苗，该疫苗比灭活的PCV2 能够诱导机体产生更强的特异性免疫反应，是一种有潜力的候选疫苗[34]。Kim 等将PCV2-ORF2 基因片段克隆到aroA基因突变后的毒力减弱的博德特氏菌（Bordetella bronchiseptica，BBS）中，获得了能够高效表达PCV2 Cap 蛋白的重组博德特氏菌（BBS-MCP），通过呼吸道将该重组菌免疫猪，攻毒实验结果显示，免疫猪能够抵抗PCV2 强毒的攻击[35]。

4.2 重组病毒活载体疫苗 Li 等构建了重组Cap 蛋白的腺病毒Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W，其能分泌表达Cap 蛋白，动物实验结果表明该重组腺病毒能诱导猪产生强烈的免疫反应，同时显著降低了猪血液和组织中的PCV2 载量，免疫组攻毒后未出现明显病理变化，其免疫效果优于商品化的PCV2 灭活苗（SH）[36]。Tao 等设计了一种同时表达PCV2 Cap蛋白和猪肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MHP）P97R1P46P42 蛋白的重组杆状病毒，分别成功表达了固定于杆状病毒囊膜及细胞质膜上的Cap 蛋白和P97R1P46P42 蛋白，实验证明该重组疫苗与混合商品疫苗的免疫效果相当[37]。Wu 等在伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）中插入PCV2 ORF2 基因，构建了高效表达Cap 蛋白的PRV 二联疫苗，该二联疫苗在小鼠和猪的实验中均诱导了高水平特异性抗体的产生[38]。

活载体疫苗免疫效果好、免疫保护期长、生产成本低、免疫方式简单、能够同时诱导细胞免疫和体液免疫反应、能够实现一针多防、减少动物的应激反应，且节省人力物力，然而所用的活载体对宿主存在潜在的安全性问题，因此提高作为活载体微生物的安全性，是活载体疫苗研发的重要方向[39]。

5 标记疫苗

标记疫苗是指利用基因工程技术于病毒的基因组中插入分子标签，配合应用相应诊断技术可用于鉴别诊断的一种新型重组活疫苗，该疫苗免疫后能够区分免疫猪和感染猪[40]。目前已有多种PCV2 标记疫苗被报道。Beach 等分别构建了携带两种分子标签（GLU 和KT3）的PCV1/2 嵌合病毒，且证明这两种嵌合病毒均能在PK15 细胞中增殖，动物实验证明它们能诱导猪产生PCV2 的中和抗体以及针对分子标签KT3 或GLU 的抗体[41]。Huang 等构建了携带分子标签V5 的重组PCV2，实验结果表明该病毒能诱导小鼠产生PCV2 的中和抗体及V5 分子标签的抗体[42]。

研发高效安全的标记疫苗与对应的鉴别诊断技术，对于控制或根除动物传染病意义重大。由于目前PCV2 在全球范围内普遍流行，因此研发高效安全的PCV2 标记疫苗与相应的诊断鉴别技术，对于PCV2 的净化具有重要意义。然而标记的分子标签可能导致动物接种后发生不良反应，因此设计理想的分子标签以规避免疫动物产生的不良反应，则PCV2标记疫苗将会有广阔的发展前景。

6 小结与展望

尽管目前商品化疫苗的抗原类型主要为PCV2a和PCV2b，但该类疫苗能够为免疫动物提供抵抗大多数其他PCV2 亚型攻击的能力[43]。然而随着PCV2的不断发变异，将导致目前疫苗的免疫保护效果下降[44]，且灭活疫苗的副反应大、免疫保护期短、研发周期长、培养病毒的滴度低等缺点难以克服，因此迫切需要研发出高效、安全、廉价、可迅速应对病毒变异的PCVD 基因工程疫苗。雾化吸入式疫苗是指通过雾化吸入方式接种的疫苗。该类疫苗能够诱导机体体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫三重保护，其免疫方式简单，免疫应激反应小，对防治猪呼吸道传染病意义重大，该类疫苗研发的难点在于抗原表达系统的选择、抗原的雾化及吸入抗原剂量的把控，目前仅有新冠雾化吸入式疫苗被批准附条件上市，而雾化吸入式PCVD 疫苗暂无报道。综上，研制雾化吸入式疫苗、cVLP 疫苗、标记疫苗及活载体疫苗均可用于PCVD 的防控，但这些疫苗仍有诸多困难亟待克服。

新冠肺炎疫情暴发以来，多种疫苗研发的技术路线同时进行，其中新型疫苗mRNA 疫苗备受关注，目前已有两款针对新型冠状病毒的mRNA 疫苗被批准上市，mRNA 疫苗是将相关RNA 在体外修饰后，通过递送载体使其穿透脂质膜进入细胞质内，进而使机体细胞表达相应的抗原蛋白，能够同时刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答[45]。与传统疫苗相比，mRNA 疫苗生产工艺简单、研发快速、生产成本低、外源基因不存在整合至宿主基因组的风险等优点，但其存在运输存储条件苛刻且技术较新等缺点[46-47]。随着PCV2 的不断变异，现有的商品化疫苗将不能对免疫猪提供很好的免疫保护，因此开发针对PCV2 变异株的mRNA 疫苗对于PCVD 的防控也是一个新途径。