山东地区规模驴场马疱疹病毒流行病学调查

张敬文，刘文强*，张健鹏，许丹丹，张 伟，姜桂苗，王长法，王彤彤，李亮亮，郭 晶

（1.聊城大学农学院，山东 聊城 252000；2.山东省农业科学院，山东 济南 250100；3.东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252000）

马疱疹病毒（Equid herpesviruses，EHV）包括EHV-1 型、4 型和8 型等血清型，常引起马属动物流产、呼吸道感染等不同程度的临床症状，严重时可导致死亡[1]。该病毒在世界范围内流行，对马属动物养殖业造成了严重的经济损失[2-3]。血清流行病学调查发现，国外马和驴群中普遍存在EHV-1 和EHV-4 感染[4-5]。1988 年澳大利亚首次从发生鼻炎、神经症状的驴体内分离到EHV-8，此后有多次驴感染EHV-8 的报道[6-7]。近年来我国驴业逐渐由传统的自然养殖向规模生产发展，特别是山东省建设了200多家规模化、标准化的驴场，并在聊城、德州、滨州、菏泽、济宁等区域逐步形成了具有地方特色的驴产业链[8]。但是，在这些规模驴场，驴驹腹泻、马鼻肺炎、母驴流产等疾病日趋增多[9]。已经发现这些疾病与EHV感染密切相关，且已分离到驴源EHV-8，但EHV 在规模化驴场中的流行情况尚无报道[10-11]。本研究以山东地区规模驴场样品为研究对象，调查EHV 在驴群中的流行现状，并分析其感染风险因素，为有效预防EHV 的感染提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 AxyPrep 体液病毒DNA/RNA 小量制备试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；DP214-通用型DNA 纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；pMDTM19-T Vector Cloning Kit、SapphireAmp Fast PCR Master Mix 购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 样品采集 随机从山东地区的76 个规模驴场采集鼻拭子样品1 834 份，-80 ℃冻存备用，样品详情见表1。

表1 样品采集统计Table 1 Sample collection statistics

1.3 引物的设计与合成 参照GenBank 登录的EHV-1（KU206465），EHV-4（JN705799）及EHV-8（MF431611）gB 和gD 基因序列，利用Primer 5.0 软件设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列和退火温度见表2。

1.4 EHV gB 和gD 基因的PCR 检测 将采集的鼻拭子样品置于1.5 mL EP 管中，加入500 μL PBS（pH7.4），涡旋震荡1 min 后利用体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒提取DNA。采用表2 中相应病原（EHV-1、EHV-4、EHV-8）的引物分别进行gB 和gD基因的PCR 检测，反应程序为：94 ℃1 min；98 ℃5 s、退火（见表2 中温度）5 s、72 ℃10 s，30 个循环。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.5 EHV gB 和gD 基因的同源性及遗传进化分析通过纯化回收试剂盒对目的基因片段胶回收后克隆至pMD19-T 载体，鉴定为阳性的菌液由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果通过BLAST 在线工具比对，采用DNAStar 进行基因同源性分析，采用MEGA 7 构建gB 和gD 基因进化树。

1.6 EHV 流行病学分析 利用SPSS16.0 软件对不同地区、不同年龄和不同季节驴的EHV 感染情况分别进行卡方检验，当P＜0.05 时，差异显著；当P＜0.01时，差异极显著；当P＞0.05 时，差异不显著。

2 结 果

2.1 EHV的PCR检测结果 通过PCR对1 834份鼻拭子样品中的EHV 进行检测，结果显示，鼻拭子样品提取的DNA 经PCR 扩增，分别获得了213 bp、386 bp 的片段，分别与EHV-8 的gB 和gD 基因相应的目的片段大小相符（图1）；未扩增到EHV-1和EHV-4 的目的片段。经测序和BLAST 在线工具比对，共检测到EHV-8 阳性样品122 份，阳性率为6.65%（122/1 834），EHV-8 场阳性率为76.32%（58/76）。结果表明，山东地区规模驴场中普遍存在驴的EHV-8 感染，但总体阳性率不高。

图1 PCR检测结果Fig.1 PCR test results

2.2 EHV-8 株同源性及遗传进化分析 从122 份EHV-8 阳性样品中随机选取9 份，对其gB 和gD 基因进行测序后进行同源性以及基因进化树分析，结果显示，挑选的9 株EHV-8 间的同源性99.9%～100.0%；9 株EHV-8 与中国北方马群中分离的EHV-8 Wh 株（JQ343919）同源性最高为99.6%～99.7%，与其他EHV-8参考株同源性为99.4%～99.5%，表明分离毒株与目前EHV-8 流行株具有较高的同源性。gB 和gD基因进化树分析结果显示，本试验中EHV-8 株与EHV-8 Wh 株为同一分支（图2），表明本实验中的EHV-8 株可能来源于国内其他地区，EHV-8 的流行应引起重视。

图2 EHV-8 gB和gD基因进化树Fig.2 Phylogenetic analysis of different EHV-8 gB and gD gene

2.3 EHV-8 检测结果的分析

2.3.1 不同地区驴EHV-8 感染情况分析 对不同地区的驴鼻拭子中EHV 的检测结果比较分析，结果显示，德州市规模驴场驴的EHV-8 感染率最高，为13.36%（29/217）；济宁市规模驴场驴的EHV-8 感染率最低为3.08%（2/65），枣庄市、烟台市和威海市未检测到EHV-8，其余地区EHV-8 的感染率在3.85%～8.33%，不同地区之间驴的EHV-8 感染率差异显著（P＜0.05，表3）。德州地区驴产业发达，该结果表明驴群密集的地区EHV-8 感染率高于其他地区，应引起重视。

表3 不同地区驴EHV-8感染率统计Table 3 Statistics of EHV-8 infection rate of the donkey in different regions

2.3.2 不同年龄驴EHV-8感染情况分析 经过对不同年龄的驴鼻拭子中EHV的检测结果比较分析，结果显示，1岁～4岁成年驴EHV-8感染率最高，为7.48%（64/856），大于4 岁驴的EHV-8 感染率居中为6.19%（19/307），0～1 岁驴驹EHV-8 感染率最低为5.81%（39/671），各个年龄的EHV-8 感染率差异不显著（P＞0.05，表4）。表明驴各个年龄段均有感染EHV-8的风险。

表4 不同年龄驴EHV-8感染率统计Table 4 Statistics of EHV-8 infection rate in the donkey of different ages

2.3.3 不同季节驴EHV 感染情况分析 通过对2019年～2020 年4 个季节驴鼻拭子样品中EHV 的检测结果比较分析，结果显示，春夏秋冬四季驴EHV-8感染率分别为6.78%（29/428）、2.14%（9/420）、2.27%（11/485）和14.57%（73/501）；春季与夏、冬两季差异显著（P＜0.05），春季与秋季差异不显著（P＞0.05）；夏季与秋季差异不显著（P＞0.05），夏季与冬季差异极显著（P＜0.01）；秋季与冬季差异极显著（P＜0.01）（表5）。表明驴的EHV-8 以冬季感染率最高，春季次之，夏秋季节感染率相对较低，可以推测EHV-8 在驴群中的感染具有季节性分布的特点。

表5 不同季节驴EHV-8感染率统计Table 5 Statistics of EHV-8 infection rate of the donkey in different seasons

3 讨 论

随着驴役用价值的降低和皮、肉用价值的增长，规模化的驴生产方式在山东等北方区域得到迅速发展，区域养殖密度和单个规模化驴养殖场的密度也随之增大。在此背景下，以疱疹病毒、马流产沙门氏菌等为代表的传染性病原体的聚集、传播和流行日趋严重。EHV-1 是OIE 法定报告的马属动物传染病，EHV-1 和EHV-4 相关报道多以马感染为主，一般利用EHV-1 和EHV-4 双价疫苗免疫[12]。冉多良等人对新疆部分地区EHV 在马群中的流行情况进行了多年的监测，发现EHV-1 和EHV-4 在马群中普遍存在，而EHV-8 在驴群中的感染已被证实，但规模驴场中EHV 的流行情况未见报道[13-14]。因此，本实验对山东省规模化养驴场EHV-1、EHV-4 和EHV-8流行情况进行了调查。

gB 为EHV 的保守基因，也是病毒增殖所必须的基因，gD 糖蛋白是最主要的中和抗体诱导蛋白，因此gB 和gD 基因常用作EHV 的检测。有报道称EHV-1 和EHV-4 的自然宿主是马，但是否能感染并引起驴的发病尚无报道。本研究在山东地区的76 个驴场中通过鼻拭子采样并通过PCR 检测，均未检测到EHV-1 和EHV-4，这表明EHV-1 和EHV-4 可能不具备对驴的宿主嗜性[15]，其具体机制尚待进一步研究。上述样品中EHV-8 的感染率为6.65%。2012年曾在黑龙江省内某一农场分离到马源EHV-8 Wh株[16]，通过同源性分析发现，本次调查的EHV-8 毒株与黑龙江省分离的EHV-8 Wh 株同源性最高。有研究表明EHV 在运输和应激过程中，会导致病毒进一步扩散[17-18]，而山东大部分地区规模驴场的驴多来自于内蒙古、辽宁等地区，EHV-8 的传播范围与运输路线一致，二者之间是否存在流行病学关联，还有待研究。通过统计分析发现，不同地区之间驴的EHV-8 感染率差异显著（P＜0.05），以德州市规模驴场驴的EHV-8 感染率最高，为13.36%。而德州作为鲁北、冀东和冀中平原驴贸易的集散地，其流通量远高于山东其他地区。本研究中德州市规模驴场EHV-8 感染率远高于其他地区，其存在的病毒传播风险应引起重视。研究还发现EHV-8具有季节性流行的特点，春冬两季EHV-8 感染率差异显著（P＜0.05），夏秋两季与冬季EHV-8 感染率相比差异极显著（P＜0.01），因此驴生产在冬季应重视生物安全，加之冬季是驴长途运输的高峰期，更易加剧EHV-8 的传播和流行。而不同年龄驴的EHV-8感染率差异不显著（P＞0.05），说明各个年龄段的驴均有被感染的风险。

本实验首次对山东地区规模驴场EHV 进行了流行病学调查，结果表明该病在山东规模驴场普遍存在，应引起广泛关注。