献血者B(A)04 亚型分子生物学鉴定1 例报告

贾波，孔永奎，赵言腾

（1.济源市中心血站质控科，河南 济源459000；2.郑州大学第一附属医院输血科，河南 郑州450052）

ABO 血型系统在临床输血和移植医学领域中具有重要意义，ABO 血型不合能引起溶血性输血反应、新生儿溶血病及移植排斥反应等[1]。 ABO 血型系统中存在一些变异型或亚型， 影响常规血型血清学的检测和判定。 近些年随着单克隆抗体的应用，对于B(A)亚型的鉴定逐渐引起国内输血工作者的重视，分子生物学试验越来越多地应用于B(A)亚型的分析研究[2]，这极大降低了误定血型而造成的输血风险。 本文通过对1 例疑难的女性献血者ABO 血型血清学的鉴定， 结合分子生物学检测最终确定其血型基因型为ABO*B(A).04/O.01.01，并探讨分析其未来献血、输血等策略。

1 对象与方法

1.1 研究对象 无偿献血者，女性，19 岁，汉族，籍贯为河南省开封市，在校大学生。 于2018 年11 月14 日第一次参加无偿献血， 血型血清学鉴定结果提示其ABO 血型正反定型不符，既往体健，无输血史。

1.2 试剂与仪器 单克隆抗-A、 抗-B 血型定型试剂（批号:20180306），抗-A1 试剂（批号：20180501），抗H 试剂（批号：20180808），人ABO 血型反定型用红细胞试剂盒（批号：20185331），以上试剂由上海血液生物医药有限责任公司提供；人源抗-A 血清（本实验室制备，效价≥128）；DNA 基因组提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）；LATaqDNA聚合酶（大连TaKaRa 公司）；KA-2200 台式离心机（日本久保田公司）、 三目显微镜 （莱卡DM500）、3730 基因测序仪（美国ABI）。

1.3 血型血清学方法 参照文献[3]采用盐水试管法进行ABO 血型正反定型、吸收放散试验。

1.4 分子生物学方法

1.4.1 DNA 抽提和PCR 扩增 采用北京天根公司的血液DNA 抽提试剂盒，按照说明书提取该献血者基因组DNA。 ABO 基因1-7 外显子的扩增采用上海生工合成的引物进行扩增， 扩增反应体系为50 μL，包括25 μL 的2x La Taq Mix(内含dNTP 和MgCl2)，2 μL 的正向引物，2 μL 的反向引物，4 μL的基因组DNA，ddH2O 17 μL，95℃预热3min，95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸50 s，扩增共计30 个循环后于72℃延伸7 min。

1.4.2 PCR 扩增产物纯化和基因测序 采用虾碱性磷酸酶及核酸外切酶I 纯化PCR 扩增产物。 于每5 μL PCR 产物中分别加入SAP 和Exo- I 各0.75 μL，37℃酶切反应30 min，80℃酶失活15 min。PCR产物经酶切纯化后作为模板，采用3730 基因测序仪进行基因测序。

1.4.3 序列比对和分析 序列比对采用Chromas 软件进行，ABO 等位基因的命名方法参照ISBT 血型抗原等位基因数据库。

2 结果

2.1 血型血清学结果 正定型与单克隆抗-A 反应呈w+，与人源抗-A 不反应，与单克隆抗-B 呈4+凝集；与抗-H 反应强度为：B 细胞＜自身细胞＜O 细胞；反定型与A1 细胞反应2+，与B 细胞、O 细胞均不反应，4℃正反定型试验有轻微增强；吸收放散试验证实该献血者红细胞上有弱A 抗原存在。 见表1。

表1 血型血清学结果

2.2 ABO 基因检测结果 对该例血型血清学鉴定不一致的标本进行1-7 外显子直接测序， 测序结果与A1.01 参考序列比对， 显示1-5 外显子无突变， 第6-7 外显子存在c.261delG，c.297A＞G，c.526C＞G，c.640A ＞G，c.657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c.803G ＞C，c.930G ＞A 杂 合 突 变， 基 因 型 为ABO*B(A).04/O.01.01。 见图1。

图1 杂合突变位于B(A)04 亚型关键核苷酸c.640A＞G

2.3 B(A)04 亚型关键核苷酸差异 与A1.01 相比，存在c.297A＞G，c.526C＞G，c.640A＞G，c.657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c.803G＞C，c.930G＞A 突变；与B.01 相比，多出了c.640A＞G 突变，提示B(A).04 的遗传背景与B.01 基因有关。 见表2。

表2 ABO*BA.04 与参考序列差异比对

3 讨论

ABO 血型的正确鉴定是保障临床输血安全性、有效性的重要前提，错误的血型鉴定结果直接引发血液的误输注。 而输注血型不合的血液可能引起输血反应[4]。因此一旦发现ABO 血型正反定型不相符，建议进一步完善检测方法[5]。 兰炯采等[6]报道，对ABO 正反定型不一致的疑难血型检定，第一步首先排除人为因素或操作失误， 第二步对应临床资料予以归纳分类， 第三步设计针对性试验验证。 针对该例ABO 正反定型不一致结果进行分析和设计进一步试验：（1）应用特殊分型试剂和吸收放散试验；（2）分子生物学方法。 具体到本例疑难血型的鉴定结果显示，正定型与单克隆抗-A（w+），与人源抗-A（-），与单克隆抗-B（4+）；与抗-H 反应强度依次为：B 细胞＜自身细胞＜O 细胞； 反定型与A1 细胞（3+），与B 细胞、O 细胞均（-）；吸收放散试验证实该献血者红细胞上有弱A 抗原存在。 根据血型血清学反应格局推测可能为B(A)亚型。 通过进一步对献血者ABO 基因的1-7 外显子测序显示：1-5 外显子无突变， 第6-7 外显子存在c.261delG，c.297A＞G，c.526C＞G，c.640A＞G，c.657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c.803G＞C，c.930G＞A 杂合突变，确定其基因型为ABO*B(A).04/O.01.01。

ABO 亚型中，B(A)亚型发生率相对比较低。 B(A)亚型从遗传学上被认为B 型，其红细胞上除表达较强B 抗原外， 同时存在较弱的A 抗原表达[7]。近些年来发现， 部分B 性红细胞能够与某些高反应能力单克隆MHO4 抗-A 产生弱凝集，并证实弱A 抗原确实存在于这部分B 性红细胞上[8]，关于B(A)亚型的报告逐渐增多。 B(A)亚型的血型血清学特点主要体现在三个方面，一是具有接近正常的B抗原特异性，与抗-B、抗H 发生较强凝集，二是表达较弱的A 抗原，红细胞与部分单克隆抗-A、抗-A1、人源抗-A 发生弱凝集，三是此类个体血清中存在针对弱抗原产生可凝集A1 细胞、 部分A2 细胞的较强抗-A[9-10]。因此，B(A)亚型的血型血清学表现为血清中存在抗-A 抗体、红细胞抗原呈“A 弱B强”的“AB 型”[11]。 此外，B(A)亚型与AwB 血型的血清学反应格局不同，AwB 血型正定型与单克隆抗-A 发生较强凝集、与抗-H 发生弱凝集，反定型时，血清中可能存在的不规则抗-A1 与A1 红细胞发生弱凝集， 这种现象由A 与B 糖基转移酶重叠的部分特异性引起[7]，二者在血清学反应格局上的区别有助于分析判断。

文献报道B(A)亚型有B(A)01～06 六种，国内报道以B(A)02（c.700C＞G）、B(A)04（c.640A＞G）、B(A)05（c.641T＞C）为主[12]。 B(A)04 是在B.01 的基础上出现了c.640A＞G 突变后出现了p.Met214Val，由一个极性亲水性氨基酸Met 变成了一个疏水性氨基酸Val，该突变可能对GTB 转移酶底物结合口袋的构象产生了影响， 使原本的GTB 转移酶具备了部分GTA 的功能，从而形成具有了双功能酶活性，造成B 强A 弱的血清学格局， 但是其表型还具有异质性，在进行血型鉴定时仍然需要我们谨慎对待。如果父母双方一条基因是BA.04， 另一条基因是A1.01，其子女表型仍然是AB 型，欲确切知道其基因型就需要进行测序， 以确保精准输血并避免溶血反应发生。 该研究因受地域限制及其他因素影响暂未能进行家系调查，其B(A).04 基因遗传自其父/母尚未确认，将在以后继续关注。

鉴于该例女性B(A)04 亚型的献血者未婚未育特殊性，无论其作为献血者还是受血者，均需要血站和输血科血型工作者引起高度重视。 郑望春等[8]报道罕见B(A)作为供血者，去白细胞悬浮红细胞输注给B 型受血者，交叉配血相合，输血后Hb 升高达到预期值，输血过程无输血反应发生，输血后随访受血者状况良好。 其原因可能为献血者红细胞上A 抗原非常弱，抗原抗体比例不适合，或受血者体内抗-A（人源抗-A）不具备特异性结合献血者A 抗原决定簇的结合位点。若作为受血者或者将来需要孕产备血时， 本着输入红细胞抗原 “从无从少”原则，可考虑输O 型或B 型洗涤红细胞。此外，提倡B(A)血型家系调查，动员更多的B(A)血型者参与自体输血、互助献血，建立能够实现红细胞长期冷冻保存的罕见稀有血液库（含信息库）[13]等，以提高B(A)血型输血的及时性、安全性、有效性。