2125 例高龄孕妇无创DNA 产前检测结果分析

宁昊丰，柴玉琼，王亚男

（洛阳市妇幼保健院，河南 洛阳471000）

高龄孕妇是指分娩年龄大于或等于35 周岁的孕妇群体。 出生缺陷儿及染色体异常儿的发生率明显增高是高龄妊娠的突出问题之一[1]。 为提高出生人口质量，2001 年我国母婴保健法实施办法及2002 年产前诊断技术管理办法明确规定对高龄孕妇进行产前诊断[2]。 然而目前常用的产前诊断方法如绒毛膜吸取术、羊膜腔穿刺术、脐带血穿刺术等，均属于侵入性操作，尽管其准确率为98%~99%，但术后流产、羊水渗漏、宫内感染等并发症的风险达0.5%~1.0%[3]，实际工作中真正愿意主动进行侵入性产前诊断的高龄孕妇只是极少数。 近年来国际上也不断建议修正对高龄孕妇直接进行侵入性产前诊断的决定[4-5]。

随着DNA 测序技术的迅猛发展，通过分析母亲外周血中的游离胎儿DNA （cell-free fetal DNA,cffDNA） 为胎儿的染色体疾病筛查与诊断提供了一个全新的策略[6]。目前孕妇外周血胎儿游离DNA无创产前检测 （Non-invasive prenatal testing,NIPT） 对染色体非整倍体的检出率可达99.2%，假阳性率为0.09%[7]。 凭借着在无创和准确方面的优越性，此技术在临床上已得到广泛应用[8-9]。

本研究通过回顾分析2015 年1 月至2018 年6 月在本院采血进行无创DNA 检测的2125 例高龄孕妇产前检测结果，比较无创DNA 与有创性产前诊断结果的符合率， 并通过电话随访统计妊娠结局，探讨无创DNA 技术在高龄孕妇中的临床应用价值及局限性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2015 年1 月至2018 年6 月在本院接受无创DNA 检测的2 125 例高龄孕妇作为观察对象，均为汉族、自然受孕、单胎妊娠，孕周为12~22 周，平均孕周（17±1.2）周，年龄范围35~47 岁，平均年龄（38.5±2.7）岁。

1.2 研究方法 抽取孕妇外周血10 mL， 送至北京贝瑞和康生物科技有限公司和家辉遗传专科医院联合开展的检测中心进行检测。 通过提取血浆游离DNA，经过末端修复，接头连接，构建文库，PCR扩增，富集后得到测序文库，质控合格后采用Next SeqCN500 高通量测序平台检测，并通过生物信息学分析计算Z 值。 平均每个样本获得的测序数据量约为3.5 M reads，唯一比对reads 数为1.8 M，单端测序读长为36 bp，基因组覆盖度为0.1×。若-3

2 结果

2.1 无创DNA 检测结果 2125 例高龄孕妇中，共检测出高风险29 例：其中21-三体10 例；18-三体4 例；13-三体2 例；性染色体异常11 例，分别为5例45，XO ，3 例47，XYY，3 例47，XXX；CNV 异常2 例，分别为del(22)(q11.2)和dup(3)(p26.3)。 阳性率为1.36%（29/2125）。 见表1。

表1 无创DNA 高风险病例的侵入性产前诊断结果

2.2 无创DNA 结果异常者行侵入性产前诊断结果 对29 例高风险孕妇进行侵入性产前诊断：行羊水穿刺手术，并进行羊水细胞培养。 通过染色体G 显带核型分析与SNP Array 基因芯片检测，最终共25 例侵入性产前诊断结果与无创DNA 提示的高风险结果一致， 分别为10 例21-三体，4 例18-三体，1 例13-三体，3 例45，XO，3 例47，XYY，3例47，XXX，1 例del(22)(q11.2)。其余4 例未发现染色体数目或结构异常。

无创DNA 的总体阳性预测值为86.21%（25/29）， 其中对于21-三体、18-三体以及性染色体数目增加（XXX/XXY）的阳性预测值均达100%（20/20）。 而对于13-三体、45，XO 以及CNV 的检测结果则出现了假阳性的情况， 阳性预测值分别为50%、60%、50%。 见表1、表3。

2.3 无创DNA 结果低风险者追踪回访结果 对2 096 例低风险孕妇进行电话回访，13 例失访，共得到有效回访数据2 083 例。 其中有1 例在孕24周的超声检测中发现胎儿骨骼结构异常， 经羊水穿刺后，通过染色体核型分析与基因芯片检测，确诊为arr[hg19]4q31.22(146844421-147304884)×3，dup 0.8 Mb。 经查阅相关文献，尽管该区段无明确致病相关报道，但是该区段包含可导致脊柱侧凸、骨骼发育不良的致病基因SLC10A7[10-11]。 通过与胎儿父母基因组比对，发现该CNV 属于新发变异，最终判定为可疑致病，经遗传咨询，决定进行引产手术。 另有2 例在孕28 周之前不明原因流产。 其余2 080 例孕妇均表示出生后孩子生长发育情况良好。 去掉失访和不明原因流产的数据后，总体阴性预测值为99.95%（2 080/2 081），见表2、表3。

表2 无创DNA 低风险病例的跟踪随访结果

表3 无创DNA 的检测效率（%）

3 讨论

《中国出生缺陷防治报告（2012）》指出我国是世界上人口出生缺陷率高发的国家， 每年约有90万出生缺陷儿诞生， 给家庭和社会带来沉重的负担。染色体异常是出生缺陷的主要原因。常见的活产儿染色体异常主要包括21-三体、18-三体、13-三体、性染色体非整倍体及CNV 等。 近年来，随着社会经济发展，晚婚晚育人口增多，国家“二胎政策”的全面开放，高龄孕妇比例逐年上升。 随着女性年龄增加，卵巢的各项功能开始退化，卵子受到的外界理化刺激不断积累， 生育染色体异常儿的概率也会增加。 传统的产前诊断方式以侵入性为主，但该技术存在一定的风险性，给高龄孕妇本人和家属带来极大的心理压力。 随着测序技术不断进步，无创DNA 在染色体非整倍体异常与全基因组拷贝数变异的检测已成为可能， 而并且以无创性和相对较高的准确性在临床获得了较广泛的应用[12-14]。

我们研究了近年来在本院进行无创DNA 筛查的2125 例高龄孕妇检测数据，以分析无创DNA的筛查效率。 其中无创DNA 对于21-三体、18-三体以及性染色体数目增加（XXX/XXY）的检测最为准确，阳性预测值均达到了100%。 对于13-三体、45，XO 及CNV 的检测阳性预测值较低。 本研究中， 无创DNA 对13-三体的筛查效能低于21-三体和18-三体的结果，与国内外报道相一致[7,13]。 无创DNA 发生假阳性可能有母体染色体核型异常、孕妇患实体肿瘤、限制性胎盘嵌合等原因[15-16]。 另外该检测与GC 含量偏向性相关， 有研究表明13号染色体的GC 含量较低，导致测序时产生偏差[17]。此外，随着孕妇年龄的增长，其淋巴细胞的X 染色体非整倍体的频率也会增加， 尤其是X 染色体的丢失增加，这也可能是造成假阳性的原因之一[18]。

在对无创DNA 检测结果低风险的孕妇回访中， 我们发现了一例通过后期B 超检测发现异常从而进行侵入性产前诊断确诊为CNV 异常的病例。 引起NIPT 假阴性的原因主要有母体外周血中的cffDNA 含量过低， 和胎儿本身染色体异常，但胎盘滋养层细胞正常等[16,19]。 另外由于测序深度和生信分析技术水平的限制，导致无创DNA 对小片段的染色体异常检测的灵敏度偏低。 因此无创DNA 低风险的孕妇，并不能完全排除异常妊娠，特别是对于出生缺陷高发的高龄孕妇， 更要做好系统全面的产前检查。

综上所述，无创DNA 检测技术凭借着在安全性、灵敏度、特异度等方面所具有的优势使广大孕妇获益。对于高龄孕妇，可优先选择进行无创DNA检测进行筛查。 此检测结果在一定假阳性，因此阳性结果必须通过侵入性产前诊断确诊。 当检测结果为阴性时，孕妇也一定要按照正规产检流程，严格进行B 超检查， 发现异常者仍需做侵入性产前诊断确诊，避免染色体异常胎儿的出生。