混合盐碱胁迫对紫花苜蓿的生长和生理指标的影响

王晓春，杨天辉，王 川，杨炜迪，高 婷

（宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002）

0 引言

土壤盐渍化及次生盐渍化是阻碍植物生长发育的非生物逆境之一。在盐碱胁迫下，植物建植困难、生长缓慢、黄化早衰、品质下降等问题[1]，对全球的土地利用率和作物生产都有影响。中国盐碱地，多是盐化和碱化协同作用对植物产生伤害。紫花苜蓿是中等耐盐碱豆科牧草，根系发达，固氮能力强，有较强的耐寒、耐旱、耐盐碱和再生能力[2]。营养价值居各类牧草之首，是改良盐碱地可选的草种之一。宁夏地处中国西北内陆，土壤盐碱化严重，是优质紫花苜蓿主产区之一。选育耐盐碱苜蓿品种，能扩大种植面积，提高盐渍化土地的利用率，对畜牧业、生态都具有重要的意义。目前对于紫花苜蓿耐盐碱的研究多集中在种子萌发阶段和以中性盐NaCl开展的胁迫[3-9]，而在苜蓿苗期以混合盐碱开展胁迫研究的相对较少。本研究以混合盐碱溶液在苜蓿苗期开展胁迫，通过对苜蓿20个品种的生长指标和10个品种的生理指标测定分析，研究混合盐碱胁迫下苜蓿生长和生理的变化规律，以期为苜蓿开展耐盐碱鉴定评价及耐盐碱机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料详见表1，多数在种子萌发期经NaCl鉴定[10]是较耐盐的紫花苜蓿品种（系）。

表1 供试紫花苜蓿种质信息

1.2 试验方法

试验于2019年在宁夏农林科学院枸杞研究所基地温棚进行。将苜蓿种子播种于无孔塑料花盆（口径21 cm，底径11.3 cm，高12 cm），以细砂和蛭石做基质。10天后间苗，每盆留有健壮、长势一致的发芽苗15株。待苗生长到三叶期进行混合盐碱（NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3的摩尔比为1:1:1:1）胁迫。按每盆土干重的0.0%(CK)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%称量混合盐，用一定量的自来水溶解为盐溶液，经测量盐溶液pH 9.8～10.0，盐溶液同时产生盐碱胁迫，视各浓度盐溶液碱度一致，差异主要由盐胁迫引起。每处理9盆，每隔10天补充10 mL营养液，土壤表面出现干裂就补充水分至饱和。

1.3 测定内容与方法

盐碱胁迫15天后统计成活率。15、30天定株测量植株地上部分高度，取平均值记为株高。30天后，从每处理选择10株长势一致的植株，用游标卡尺测量根颈处主根直径记为根粗，直尺测量主根系根颈到根尖的长度记为根长；每处理随机取15株植株，5株为一组，分3组，在根颈处用剪刀将地上、地下部分分开，恒温箱烘干地上、地下部分，分别称重。

盐胁迫10天后，每个处理取15株顶部嫩叶作为混合样，放入液氮罐带回实验室，储存于-80℃冰箱中备用。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸法测定，可溶性糖(SS)含量测定采用苯酚比色法测定，叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)采用分光光度计法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用四氮唑蓝(NBT)法测定，过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法测定，过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法测定[11]。测定时每个处理重复3次。

从供试的20个品种中选择长势较好的10个品种测定生理指标，从而分析盐碱胁迫对较耐盐碱品种生理的影响。

1.4 数据处理

利用Excel 2003软件整理数据并制图，采用SPSS 19.0软件进行方差分析（Duncan法）。

2 结果与分析

2.1 混合盐碱胁迫对苜蓿苗期生长指标的影响

随着盐浓度的递增，20个苜蓿品种的株高均呈规律性变化（表2）。在0.3%的盐浓度处理下，株高最高。随着盐浓度的增加(0.6%、0.9%)，株高下降，但仍高于对照，当盐浓度为1.2%时株高最低，表明低、中浓度的盐碱溶液促进了苜蓿植株的生长。

表2 20个苜蓿品种在盐碱胁迫下的株高 cm

对成活率、根粗等指标统计见表3。20个苜蓿品种的成活率与根粗2个指标的变异系数相对较低(1.8%～14.0%)，而根长、地上、地下生物量3个指标的变异系数较高(14.7%～36.3%)。成活率、根粗随着盐浓度的增加，变异系数均在1.2%的盐浓度下最高。根长、地上和地下生物量的变异系数在0.0%和1.2%时均高于其他处理。在盐浓度为0.3%、0.6%、0.9%时，20个苜蓿品种都保持了较高的成活率，相对成活率分别为96.1%、94.9%、91.9%，但当盐浓度为1.2%时，相对成活率降为85.1%，显著低于其他处理。

根系是植物与土壤直接接触的器官，土壤中盐碱的胁迫最先对根系产生影响。由表3可知，根粗、根长在盐浓度为1.2%时显著低于其他处理(P<0.05)。地上生物量与地下生物量的变化一致，均在0.3%盐浓度处理下最高，变化规律同株高。

表3 盐碱胁迫下苜蓿成活率、根粗、根长、地上、地下生物量的变化

2.2 混合盐碱胁迫对苜蓿生理指标的影响

2.2.1 混合盐碱胁迫下脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、丙二醛(MDA)含量的变化 不同苜蓿品种在不同浓度的盐处理下各生理指标变化不同。10个苜蓿品种叶片Pro、SS、MDA含量在1.2%盐处理下最高（图1），且与其他处理差异显著。而在其他4个盐浓度处理下，Pro、SS、MDA含量在苜蓿品种间变化差异较大。叶片Pro含量由大到小依次为0.3%、0.9%、0.0%、0.6%的盐处理，而SS的含量为0.6%、0.3%、0.9%、0.0%的顺序，MDA含量则为0.9%、0.0%、0.6%、0.3%。

图1 盐碱胁迫对苜蓿叶片脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量的影响

2.2.2 混合盐碱胁迫下叶绿素含量及抗氧化酶活性的变化 在不同浓度的盐处理下，10个苜蓿品种叶片的叶绿素a、b含量变化一致。但总叶绿素含量(Chla+Chlb)在不同盐处理下，品种间变化不同（表4）。在0.3%的盐浓度胁迫下‘耐盐’、‘德国大叶’、‘敖汉’、‘固原紫花’、‘中苜1号’的叶绿素含量最高，当盐浓度为1.2%时‘耐盐’、‘岩石’、‘德国大叶’、‘固原紫花’、‘盐宝’的叶绿素含量最低，而其他品种在不同浓度盐碱下叶绿素含量变化无规律。

表4 10个苜蓿品种在盐碱胁迫下的叶片叶绿素含量 mg/g

在不同浓度盐处理下，10个苜蓿品种叶片SOD、POD、CAT的活性变化在品种间有差异，但整体呈现出一定的规律（表5）。SOD活性在0.9%、0.6%、1.2%的处理下显著高于0.0%和0.3%的处理；POD活性在盐浓度0.9%和1.2%胁迫下显著高于其他处理；CAT活性在1.2%盐胁迫下最高，且与其他处理差异显著。由此可见，苜蓿叶片抗氧化酶SOD、POD、CAT活性均在盐浓度1.2%的处理下变化突出，显著高于对照。

表5 盐碱胁迫下苜蓿叶片SOD、POD、CAT活性

3 结论

当混合盐浓度为1.2%时，盐碱胁迫对苜蓿苗期的生长及生理变化影响较突出，1.2%的混合盐是开展苜蓿苗期耐盐碱评价及耐盐机理转录组、代谢组等研究的适宜浓度，但不建议以生理指标直接做为苜蓿耐盐碱评价指标。因为当受到盐碱胁迫时，苜蓿体内各生理指标动态变化，与胁迫时间紧密联系，同时各生理指标在苜蓿品种间存在差异，无法直接通过生理指标评价不同苜蓿材料的耐盐碱性。

4 讨论

4.1 混合盐碱胁迫对苜蓿生长的影响

各苜蓿品种在不同盐浓度的盐碱胁迫下相对成活率都很高，说明苜蓿只要成功萌发、扎根就会相对耐盐碱。而李波等[12]以NaHCO3对4个苜蓿品种苗龄4周幼苗开展胁迫发现，当盐浓度为150 mmol/L（约1.35%）时，4个品种成活率仅16.7%。而本研究以1.2%的混合盐胁迫2周龄的幼苗，20个苜蓿品种平均成活率达81.3%，远高于前者，结果的不同有可能是碱性盐NaHCO3对苜蓿幼苗的伤害大于混合盐引起的。

在各梯度混合盐碱胁迫下，苜蓿株高与地上、地下生物量的变化规律一致。均在盐浓度为0.3%的盐碱胁迫下最高，0.6%、0.9%时依次降低，对照(0%)与1.2%盐处理下最低。这个变化规律说明1.2%浓度的盐碱胁迫对苜蓿生长、生物量的积累有阻碍，与对照相比，其他浓度盐碱胁迫对苜蓿生长都有促进作用。尤其是中、高浓度的盐(0.6%、0.9%)碱胁迫对苜蓿生长、生物量都有促进作用的结果，说明低、中浓度的盐碱胁迫促进了苜蓿苗期的生长，苜蓿相对耐盐碱。这个结论与田小霞[13]、刘晶[14]等的研究结论差距较大。田小霞以NaCl胁迫苜蓿属132份样本幼苗，结果显示当盐浓度为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%时，苗高都低于对照(0.0%)，说明盐胁迫对苜蓿生长只有抑制作用。而刘晶认为低浓度盐胁迫对苜蓿生长无显著影响。根粗、根长在盐浓度为1.2%的盐碱胁迫下最低，而在其他处理下差异不明显，反映了在此浓度胁迫下，苜蓿生长受到明显的抑制。地下、地上生物量的变化与株高相对应，在0.3%、0.6%、0.9%浓度的盐碱胁迫下，都高于对照。与张晓磊等[15]的结论“低浓度混合盐碱对紫花苜蓿根系的生长影响不显著或具有一定的促进作用，高浓度盐碱胁迫抑制根系的生长”一致。

4.2 混合盐碱胁迫下苜蓿生理指标的变化

Pro和SS是植物遭受逆境胁迫时大量积累的小分子有机化合物，通过渗透调节降低水势，维持较高的渗透压，保证细胞的正常生理功能。MDA含量变化在植物逆境生理研究中也非常重要，可通过MDA含量的变化间接评价植物在高盐环境下膜系统的伤害程度。

10个苜蓿品种的生理指标分析结果显示，不同的生理指标在苜蓿品种间变化有差异。本研究以多数苜蓿品种变化规律分析盐碱胁迫对苜蓿生理指标的影响。在不同浓度混合盐处理下，Pro、SS、MDA含量的变化呈现一定的规律，均在1.2%盐处理下最高，而在其他处理下差异不明显。说明1.2%的盐浓度对苜蓿细胞内含物有影响。杨科等[16]以混合盐碱胁迫燕麦幼苗，随着盐浓度升高，MDA含量增加，Pro和SS累积，但当盐浓度为100～200 mmol/L时，有的品种的Pro和SS含量下降。江超等[17]以NaCl对2个苜蓿品种开展胁迫，随着盐浓度和天数的增加，苜蓿根部Pro、MDA含量均呈现明显的先升高后降低的趋势，且高盐溶液升高的趋势要明显大于低盐溶液升高的趋势。时丽冉等[18]以Na2CO3胁迫水稻种子，发现无论是高浓度盐还是低浓度盐都使幼苗中的MDA含量增大、Pro含量升高。以上结论都与本研究结果有差异，结合苜蓿生长指标，本研究认为当盐浓度为1.2%时，盐碱胁迫对苜蓿生长有显著的抑制作用，所以在此浓度下，Pro、SS含量积累，MDA含量增加。

叶绿素是绿色植物进行光合作用的主要色素。在逆境条件下，植物对胁迫的响应表现为光合作用下降和光合色素含量降低[19]。在本研究中，有的苜蓿品种在混合盐碱胁迫下，随着盐浓度的递增，叶绿素含量先升高后下降（盐浓度为0.3%时最高，1.2%时最低），与苜蓿生物量变化相对应。而有的品种在不同浓度盐碱胁迫下，叶绿素含量变化无规律。李杰等[20]研究结论“低浓度的盐碱胁迫促进了苜蓿叶绿素的积累，但中高浓度盐碱胁迫致使叶绿素含量下降”与本研究部分苜蓿品种叶绿素含量变化一致。但有的研究者认为，随着盐浓度升高，苜蓿叶绿素含量下降[21-22]，也有人认为叶绿素的量只是反映了高盐环境中光合作用的强弱，不能直接反映植物的耐盐性[23]，这与本研究中有些苜蓿品种在不同浓度盐碱胁迫下叶绿素含量变化无规律的结果相同。

研究发现，逆境胁迫下植物叶片中SOD、POD和CAT活性增加，或者严重胁迫时呈先增加后降低的规律[20,23-24]。本研究中苜蓿品种的抗氧化酶活性在盐浓度为1.2%时显著高于其他浓度处理，说明此浓度的盐胁迫对有些苜蓿品种叶片抗氧化系统有影响。张喜斌等[25]开展6个苜蓿品种的苗期耐盐性鉴定，在300 mmol/L（约1.76%）NaCl胁迫下SOD、POD活性均出现了下降，但CAT活性却有不同程度的上升。时丽冉[26]以混合盐碱对7个小黑麦品种进行胁迫，发现SOD、POD活性增高，而CAT在有的品种上表现为在低浓度盐胁迫下升高、在中高浓度盐胁迫下降低，有的品种却一直上升。杨升[27]以NaCl胁迫沙枣树幼苗，当盐浓度为300 mmol/L（约1.76%）时SOD活性明显降低，而在其他浓度下与对照无显著差异，认为SOD可能不是盐胁迫下沙枣幼苗的主要抗氧化保护酶，也可能SOD只在盐胁迫初期（<40天）活性提高，对细胞膜系统起保护作用。这都与本研究结果不同，由此可见，抗氧化酶活性的变化较敏感，在植物种类、品种间差异较大。

植物在盐碱性环境下，通过各种生理变化来维持正常生命活动，其作用机理尚不明确。本研究以混合盐碱模拟大田盐碱环境，比较不同盐度梯度下苜蓿苗期的生长与生理指标的变化，可为耐盐碱苜蓿品种的选育及今后开展苜蓿耐盐碱机制研究提供参考。