超高效液相色谱-质谱法检测妇科止带胶囊中马皮源成分

黄晓燕，李荣玮，刘雁鸣，梁晟，李瑞莲

湖南省药品检验检测研究院，湖南省药品质量评价工程技术中心，湖南 长沙 410001

妇科止带胶囊具有收敛止带、清热燥湿等功效，临床上常用于治疗湿热型赤白带等症［1］。本品为中药复方制剂，由椿皮、龟甲、阿胶等7 味药材组成，处方中龟甲制备方法为加水煎煮，故在提取过程中能生成龟甲胶成分。

目前，市场上驴皮、龟甲原料供应紧缺，价格昂贵，某些不法生产企业为了谋取更高的经济效益，可能出现将马皮充当正品胶类投料造假掺伪等现象，严重影响着患者的用药安全。为了保证胶类药材的质量及打击掺伪造假，药品监管部门陆续出台一系列的检验检测方法［1-4］。妇科止带胶囊现行质量标准为《中国药典》2020 年版一部，正文项下收载有阿胶的特征肽鉴别。本品虽有阿胶的鉴别项目，但无检测杂皮投料的项目，难以对马皮造假和掺假的现象进行检查和监管。因此，本研究根据有关文献［5-9］报道中的测定方法，采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）识别技术，建立了马皮源成分的限量检查方法，并对收集到的妇科止带胶囊样品进行测定，以便为含胶类中成药产品质量控制和科学监管提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AE240 电子分析天平（METTLER）；SBL-30DT超声波清洗器（宁波新芝有限公司）；Ultimate3000-TSQ 液质联用仪（DIONEX）。

1.2 试药

马源寡肽A 对照品（批号：112035-202002，纯度：90.5%）；阿胶对照药材（批号：121274-201904）均由中国食品药品检定研究院提供。所用甲酸、乙腈为质谱纯，胰蛋白酶为质谱级（Sigma 公司），水为蒸馏水，试验用的其他试剂均为分析纯。8 批妇科止带胶囊样品均从市场上购得（企业A，样品批号：1803002、1906001，规格：每粒装0.3 g；企业B，样品批号：1905002、1901001、1811005、1807004、1805003，规格：每粒装0.3 g；企业C，样品批号：20200501，规格：每粒装0.46 g）。阴性样品按处方自行制备而得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），进样量为5 μL，柱温为35 ℃，流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱：0～5 min，5% A；5～10 min，5% →20% A；10～12 min，20%→50% A；流速为0.3 mL/min。

2.2 质谱条件

ESI+模式，离子源温度110 ℃，毛细管电压为3.1 kV，鞘气流速600 L/h，去溶剂化温度350 ℃，扫描模式为MRM。选择m/z 386.4（双电荷）→377.3（定量用）、m/z 386.4（双电荷）→322.3 为检测离子对，碰撞能量为25 V，检测离子对的MRM 色谱峰的信噪比均不得小于10∶1。

2.3 对照品溶液的制备

阿胶基质溶液的制备：精密称取阿胶对照药材粉末，用1%碳酸氢铵水溶液溶解制成每1 mL 含2 mg 的基质溶液，即得。

精密称取马源寡肽A 对照品10.05 mg，置于50 mL 容量瓶中，用阿胶基质溶液溶解并稀释至刻度，即得对照品贮备液。取马源寡肽A 对照品贮备液，用阿胶基质溶液稀释制成0.2 μg/mL 的溶液，取适量该溶液，用微孔滤膜（孔径0.22 μm）过滤，精密量取100 µL，加入制备好的胰蛋白酶溶液10 µL（1 μg/μL），混匀，水浴恒温（37 ℃）酶切处理12 h，即得。

2.4 供试品溶液的制备

取妇科止带胶囊样品20 粒内容物，研匀，取约0.3 g，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，加1%碳酸氢铵水溶液约45 mL，置于超声波清洗仪中提取（功率840 W，频率40 kHz）30 min 使样品溶解，用1%碳酸氢铵水溶液稀释至刻度，摇匀，取适量上清液，用微孔滤膜（孔径0.22 μm）过滤，精密量取续滤液100 μL，加入胰蛋白酶溶液10 µL，同对照品制备方法进行酶切处理，即得。

2.5 阴性样品溶液制备

称取自行制备的缺阿胶、龟甲的阴性样品约0.3 g，同供试品制备方法制成阴性样品溶液。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 按“2.1”及“2.2”项下条件，吸取马源寡肽A 对照品溶液、阴性样品溶液与妇科止带胶囊供试品溶液各5 µL，进行测定。结果妇科止带胶囊中其他药味对胶类特征肽测定无干扰，方法专属性强，见图1。

图1 不同溶液中马源寡肽A特征离子色谱图:A.马源寡肽A对照溶液；B.阴性样品溶液；C.样品溶液

2.6.2 稳定性试验 取马源寡肽A 对照品溶液，于配制后的0、4、12、24 h，分别按“2.1”及“2.2”项下条件测定。结果马源寡肽A 的峰面积值RSD 为5.2%。

2.6.3 精密度试验 按“2.1”及“2.2”项下条件，吸取马源寡肽A 对照品溶液，连续6 次测定。结果马源寡肽A 定量离子对的峰面积值RSD 为4.9%，仪器精密度较好。

2.6.4 线性关系 吸取适量对照品贮备液，制成含0.036 38、0.072 76、0.181 9、0.363 8、0.727 6 µg/mL 的系列溶液，依法测定，绘制标准曲线。横坐标为对照品的量，纵坐标为定量离子对峰面积值，结果回归方程：Y=1.0×106X+21 161，r=0.997 8，结果表明在0.036 38～0.727 6 µg/mL 范围内，马源寡肽A 掺入量与色谱峰面积呈线性关系。

2.6.5 检出限 取马源寡肽A 对照品贮备液进行逐级稀释，以马源寡肽A 肽定量离子对色谱图信噪比为3∶1 计算检出限，检出限为1.8 ng/mL。

2.6.6 回收率试验 取妇科止带胶囊样品（批号：1905002，未检出马源寡肽A）6 份，每份称取约0.3 g，分别加入0.363 8 μg/mL 的对照品溶液25 mL，再加1%碳酸氢铵水溶液约20 mL，同“2.4”项下方法制备溶液，采用马源寡肽A 定量离子对依法测定，平均回收率为93.59%，RSD 为3.69%，结果表明回收率较好，方法可行。

表1 回收率试验

2.7 样品测定结果

取妇科止带胶囊样品，照“2.4”项下方法制备，按“2.1”及“2.2”方法测定。结果3 家企业的8批样品均未检出马源寡肽A。

3 讨论

3.1 基质效应考察

为了考察样品中的基质对待测成分的影响，分别以相应浓度的阿胶、阴性样品溶液为基质，配制参比溶液，并与以碳酸氢铵溶液为溶剂的参比溶液进行比较，结果以阿胶基质和以阴性样品基质所得的参比溶液响应值接近，为了便于标准执行，选择以阿胶基质进行参比溶液的制备。

3.2 限度的拟定

为了避免发生客观原因驴皮中混入微量马皮造成结果误判的情况，规定马皮源成分的检出比例十分有必要。参考文献中的相关限度规定［8-9］，将妇科止带胶囊样品马皮源成分检查的限度定为5%，即大于5%可判定为存在马皮源掺伪，小于或等于5%可判定为不存在掺伪。由于0.2 μg/mL 的对照品约相当于5%的马皮源成分，故拟定马皮源检查的参比溶液的限度为0.2 μg/mL。

3.3 样品质量分析

对妇科止带胶囊的检测结果显示，8 批均未检出马皮源成分，说明该品种暂未存在马皮掺伪投料的情况。本研究建立的方法专属性强、灵敏度高、准确、高效、简便，可以有效控制和监管马皮掺伪投料的不法行为，为含胶类制剂的科学监管和质量控制提供保障。