基于高通量测序的黑柄乳菇菌塘细菌多样性分析

秦婉琳，马永远，李双燕，伍 燕

（兴义民族师范学院，贵州兴义 562400）

黑柄乳菇（Lactarius gerardii）又名茅草菌，隶属伞菌目（Agaricales）红菇科（Russulaceae）乳菇属(Lactarius)，菌盖和菌柄呈黑褐色，菌褶白色延伸至菌柄，菌肉白色、质脆，受伤后会溢出白色乳浆，因此又叫黑盖奶浆菌；夏季多生长在针阔混交林地上，是一种美味的野生菌[1]。图1（参见封三）为野生黑柄乳菇子实体，采集地点为兴义市万屯镇云屯生态公园松林下。乳菇属在贵州比较常见，例如松乳菇（紫花菌）、多汁乳菇、红汁乳菇、靓丽乳菇等[2-3]。近年研究表明，通过人工合成松乳菇菌体并接种到天然马尾松林下，能得到松乳菇子实体[4-9]。松乳菇营养丰富，含多种氨基酸和微量元素，具有增强机体免疫力、抗氧化和抗肿瘤等生物活性[10-15]，松乳菇的栽培成功对开发利用黔西南地区的黑柄乳菇具有参考价值。

图1 黑柄乳菇子实体

菌塘（Shiro）是由子实体的根部菌丝、宿主根系及周围的腐殖质土壤扭结形成的颗粒状结构，是真菌菌丝体萌发和形成子实体的重要条件[16-17]。深入研究菌塘，对于开发人工驯化技术，了解菇类栽培土壤细菌群的组成及丰度非常重要。本文以黔西南州的野生黑柄乳菇菌塘土壤为研究对象，高通量测序菌塘菌群后采用统计聚类的方法确定不同样本优势菌群结构的分型，旨在探究黑柄乳菇生境土壤微生物群落特征，找出优势菌群、分析共性并得出规律性认识，为下一步研发黑柄乳菇的人工栽培技术奠定一些基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

选取黑柄乳菇出产丰富的五个采集点：兴义市万屯镇云屯生态公园（WT）、安龙县新桥镇（XQ）、安龙县海子镇（HZ）、安龙县平乐镇（PL）、安龙县龙广镇（LG）。每个地点选取黑柄乳菇成簇生长的菌塘，在距菌根2 cm半径周围处取土样，混合后放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2 药品及试剂

Qubit3.0 DNA 检测试剂盒，美国Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 试剂盒，美国OMEGA 公司；2×Taq Master Mix，南京诺唯赞生物技术公司；MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金生物技术公司。

1.2 仪器和设备

Pico-21 台式离心机，美国赛默飞公司；Bio-Rad PCR 扩增仪、凝胶成像仪，美国伯乐公司；Q32866 Qubit®3.0荧光计，美国英杰生物技术公司；DYCZ-21电泳槽、DYY-6C型电泳仪电源，北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

称取200 mg土样，放入灭菌的2 mL离心管中，加入1 mL PBS 缓冲液混匀，10 000 rpm 室温离心3 min，弃上清，样品干燥待用。

1.3.2 总DNA提取和检测

按照OMEGA 试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 使用说明操作提取总DNA，1%琼脂糖凝胶检测DNA完整性。

1.3.3 PCR扩增及测序

宏基因组测序类群为细菌；扩增区域为细菌V3～V4变区，引物1为341F:CCTACGGGNGGCWGCAG，引物2 为805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC，测序平台为Miseq，由生工生物工程(上海)公司完成。

1.3.4 数据分析

高通量测序序列（reads）通过拼接、过滤、去除嵌合体及非特异性扩增序列，进行OTU（Operational Taxonomic Unit）聚类分析和物种分类学分析。基于OTU 聚类分析结果，对OTU 进行多样性指数分析、多样性的群落组成分析，对系统发育信息进行Beta 多样性分析、分组检验分析、差异显著性检验、环境因子分析等深入的统计学和可视化拟合。

2 结果与分析

2.1 菌塘Alpha多样性指数分析

表1 为各个菌塘土壤高通量测序数据Alpha 多样性指数分析结果，可以反映所测微生物群落的丰度和多样性。由表可知，五个菌塘土样测序共得到140 903条有效序列，过滤后得到4 385 个有效OTU，样品的Coverage 指数≥0.99，覆盖率高，能真实反映样品的测序情况。

表1 菌塘土壤中细菌Alpha多样性指数分析

样品的ACE 指数和Chao 指数反映群落分布丰度（Communit richness），数值越大说明样本的菌群分布丰度越好；Shannoneven 指数越高或Simpson 指数越低，说明采样点的菌群多样性较丰富。从表1 可以看出，龙广（LG）菌落较丰富、多样性较好。

图2为五个菌塘菌群样品的稀释曲线，Shannon指数先呈直线上升，后趋向平稳，表明测序数据能较好地覆盖菌塘中菌群的信息序列，曲线在平滑稳定后产出的OTU 数趋于稳定，其中来自海子（HZ）的样品Shannon 指数稍低，说明该采集地的细菌多样性低于其余四个菌塘。

图2 五个菌塘中菌群的稀释曲线

2.2 各样品中细菌类群的相关性分析

图3（参见封三）为五个菌塘菌群基于OTU 序列所作的聚类树，可以看出HZ 和PL 聚成一类，并和LG、XQ 位于同一簇上，WT位于较远分支，直观反映了各个菌塘菌群的相似性和差异关系。

图3 样品OUT数的聚 类树

图4（参见封三）的韦恩图为各个菌塘菌群间OTU 关联分析，反映了各自生境中土壤菌群的复杂性和共性。五个菌塘共有的OTU 数是471 个，各个菌塘菌群互有重叠，反映的是菌塘间的共性；不重叠部分除了万屯（WT）较多，有104个OTU外，其余菌塘均较少。除了万屯（WT）位于生态公园内，人类活动影响较小之外，其余四个采集地都在安龙县农业生产区。数据分析结果直观反映出各菌塘土壤基质微生物种类相似性和差异性。

图4 各个菌塘菌群多样性的关联分析

2.3 菌塘中细菌组成分析

五个菌塘细菌菌群归属于9 个门，即变形菌门（Proteobacteria，68.88%～43.97%）、酸杆菌门（Acidobacteria，30.24%～10.33%）、放线菌门（Actinobacteria，15.70%～4.78%）、浮霉菌门（Planctomycetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、candidate_division_WPS-1、绿弯菌门（Chloroflexi）和candidate_division_WPS-2，从图5（参见封三）中可知，以变形菌门、酸杆菌门和放线菌门为主。

图5 不同菌塘门水平分类丰度统计

由图6（参见封三）可见，各菌塘在属级水平上比较丰度，有27个属，平乐（PL）菌塘主要的属有缓生根瘤菌属（Bradyrhizobium，7.52%）、伯克氏菌属（Burkholderia，5.89%）、Gp1（7.02%）；万 屯（WT）菌塘主要的属有缓生根瘤菌属（Bradyrhizobium，6.35%）、根瘤菌属（Rhizobium，5.6%）、假单胞菌属（Pseudomonas，5.55%）；新桥（XQ）菌塘主要的属有伯克氏菌属（Burkholderia，9.53%）、假单胞菌属（Pseudomonas，5.67%）、Gp1（4.39%）；海子（HZ）菌塘主要的属有Gp1（10.24%）、Gp2（9.5%）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium，8.86%）、伯克氏菌属（Burkholderia，6.54%）；龙广（LG）菌塘主要的属有缓生根瘤菌属（Bradyrhizobium，6.51%）、Gp2（4.72%）、Gp1（4.16%）。

图6 不同菌塘属水平分类丰度统计

结合各个菌塘门、属水平统计及表2 所列前几种优势属可知，各个菌塘中的优势菌门和属均是变形菌门及其下属，这些菌群能起到固氮及吸收转化磷、钾等无机盐的作用，并与黑柄乳菇菌丝、土壤腐殖质等扭结形成菌根菌共生体，外部表现为根瘤形态。同时注意到各个菌塘的酸杆菌门及酸杆菌属Gp1、Gp2 和Gp3 含量较高，通常认为这些菌增多可对被污染土壤进行修复。

表2 五个样品中的优势细菌属及其相对丰度

3 结论

采用高通量测序技术结合生物信息学对黔西南州的野生黑柄乳菇五个菌塘进行分析，对菌群的组成和丰度形成了一个规律性的认识。各个菌塘中以变形菌门、酸杆菌门、放线菌门为主，菌群的组成类型变化不大但丰度上有区别，例如万屯（WT）菌塘变形菌门丰度达到68.88%，龙广（LG）菌塘变形菌门丰度为43.97%；海子（HZ）菌塘酸杆菌门丰度为30.24%，万屯（WT）菌塘酸杆菌门丰度为10.33%。采样点万屯镇云屯生态公园环境保护相对较好，土壤有机质丰富，黑柄乳菇生活的菌塘中以固氮和转化磷、钾元素为主的变形菌门居多[18-19]；海子镇是安龙县粮食主产区，自然环境受人类生产活动影响较大，与万屯相比酸杆菌门丰度较高（通常认为在人类生产活动较多的环境，例如过度施肥、喷施农药等会引起土壤中酸杆菌属含量升高）。酸杆菌门的Gp1、Gp2、Gp3能降低土壤中的重金属和农药污染[20]，有助于恢复土壤生态。

乳菇作为贵州食用菌“黔菌”品牌重点打造的项目之一，其中的松乳菇已有少量人工栽培，但远不能满足市场需要。兴义野生黑柄乳菇在当地出产丰富，味道鲜美，深受消费者喜爱，市场价格也在逐年攀升。对黑柄乳菇的菌塘菌群组成和丰度开展研究，进行深入了解，对下一步做“精”、做“特”食用菌产业具有理论指导意义。通过本次分析，发现生境中的酸杆菌门菌群较丰富，说明人类在野生菌产出区域活动过于频繁，对土壤的理化性质已造成影响，提醒我们注意保护当地生态环境，保护野生黑柄乳菇及其他野生食用菌的可持续生长和出产品质。