茵芋花粉生活力测定及其贮藏方法优化

阮淑明

（福建林业职业技术学院 林学系，福建 南平 353000）

茵芋（Skimmia reevesiana Fortune）属于芸香科（Rutaceae）茵芋属（Skimmia Thunb），常绿灌木，又名黄山桂，原产于我国长江中下游地区，在华南、云贵地区亦有野生种类分布[1-2]，据报道：茵芋属的名称是由日本语sikimi音译过来的[3]。花单性，白色[4]，是观叶、观花、观果俱佳的优良花木。茵芋系芳香植物，花可提取芳香油，种子可榨油，是一种较好的辅助蜜粉源植物[5-6]，茵芋正成为重要的园林绿化植物，常作林缘种植，也可作盆景。

花粉生活力是指花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力[7]。花粉生活力的测定是检测花粉质量的重要手段，可用来对花粉贮藏效果进行鉴定，完善、改进花粉贮藏方法，研究花粉保存机理等，对于杂交育种有非常重要的意义[8]。

茵芋为雌雄异株，雌雄花期经常不一致，因此花粉活力测定可能决定育种的成败，可为茵芋推广种植时授粉时间的遴选及生产中制定花期喷硼的促果技术等提供依据。

1 试验材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为福建省洋口国有林场提供的茵芋植株，采集正开放的花，由于茵芋花小，故直接取出花药，进行花粉生活力测定，IBE 2000型倒置生物荧光显示镜下观察并拍照。

1.2 花粉活力测定试验

1.2.1 离体萌发试验

花粉生活力状况的主要衡量标准是其萌发率的高低[8]，离体萌发试验是用体积分数分别为0.7%，15%，0.05%和0.02%的琼脂、蔗糖、硼酸、氯化钠配制培养基[9]，将配制好的培养基平铺一薄层于培养皿中，冷却后用镊子夹取花药，把花粉均匀涂于培养基上。盖上培养皿，放在铺有湿纱布的白磁盘里，25℃恒温培养箱中暗培养，24 h后观察其萌发率，花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发[10]，试验处理重复3次。

1.2.2 计算萌发率

每处理取3～4个视野，共10个视野，每个视野统计不少于50粒花粉。萌发率=（视野萌发花粉粒数÷视野总花粉粒数）×100%[11]。

1.2.3 三种花粉染色方法

参考I2-KI染色法[12-14]、TTC染色法[12-14]、红墨水染色法[14-16]。每次染色前用镊子夹取花药，轻轻抖动将花粉散落在载玻片上，在花粉处滴上染色液，盖玻片盖住染色液，滤纸吸去多余染色液，放入倒置显微镜下观察。测定茵芋花粉生活力，以期筛选出快速、准确、有效的测定茵芋花粉生活力的方法。

I2-KI染色法结果判断：凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。

TTC染色法结果判断：凡是被染成红色的为具较强生活力的花粉粒，呈淡红色的为微弱活力的花粉粒，无色的判定为无活力或不育。

红墨水染色法结果判断：凡是被染成红色的花粉为失去活力的花粉。未被染色的为活力较强的正常花粉，淡红色的活力次之。

每种染色法观察3个制片，每片取3～4个视野，共10个视野，每个视野统计不少于50粒花粉的染色率，计算有生活力花粉百分率的平均值。花粉活力=（有生活力的花粉数目÷花粉粒总数目）×100%。

1.3 花粉贮藏试验

1.3.1 花粉贮藏预试验

由于茵芋花较小，且花药散粉不完全，故在盛花期，用镊子采下当天盛开的花朵，剥除花瓣，留下花药，置于培养皿中，分别在室温(16～31℃，白天平均湿度55%，晚上平均湿度89%)、4、0、-12、-20℃环境下贮藏花粉，1 d后开始测定花粉活力。

1.3.2 预处理后花粉贮藏试验

将采集到的盛花期花药置于称量纸上在阴凉的室内预先晾干2～4 h，使花粉水分下降到一定水平，再用锡泊纸包住放入底部放有干燥剂的5 mL指形管中，每管放入2～3个花药，活力检测时取出花药自然散粉并进行活力检测。

室温贮藏：将带花药的指形管置于实验室内，室温环境中；4℃冷藏：将带花药的指形管置于普通海尔冰箱冷藏室中贮藏；0℃低温：将带花药的指形管置于普通海尔冰箱冷冻室中贮藏；-12℃低温：取2支带花药的指形管依次在4℃冷藏室、0℃冷冻室过渡预冷4 h后再放进-12℃ DW-25L262型海尔医用低温保存箱中；-20℃低温：取2支带花药的指形管依次在4℃冷藏室、0℃冷冻室、-12℃保存箱中过渡预冷4 h后再放进BCD-539WT型-20℃冷冻冰箱中。

以上各处理均在1 d后，根据采用染色法试验中筛选出的较适宜方法，开始测定花粉活力。试验数据使用SPSS 17.0进行统计。

2 试验结果与分析

2.1 花粉活力测定试验

根据染色法的判断结果统计，I2-KI染色法、TTC染色法的染色效果区别不明显，而红墨水染色法的试验结果从表1可看出，与离体萌发法相近。

表1 茵芋花粉生活力测定方法比较Tab.1 Comparison of methods for determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune

离体萌发试验：茵芋花粉从4 h开始萌发，从花粉粒表面长出透明状突起，随着时间的推移逐渐伸长形成花粉管，22 h后均达到萌发标准。

I2-KI染色法：全部花粉着色呈现红褐色（图1，A），按照此方法的判断标准，茵芋花粉生活力极差甚至无生活力，与离体萌发法差异大。

TTC染色法：花粉均不着色（图1，B），按照此方法的判断标准，茵芋花粉生活力极差甚至无生活力，与离体萌发法差异大。

红墨水染色法：红墨水染色茵芋花粉，无活力花粉能均匀着色，并与有生活力花粉区别明显（图1，C），所得出有活力花粉的比率经方差分析与离体萌发试验差异不显著。

图1 染色花粉与室温花粉Fig.1 Dyed pollen and room temperature pollen

三种染色法试验中只有红墨水染色能较明确区别茵芋有无生活力的花粉，也就是红墨水染色法能够快速有效地检测花粉活力，故本次试验采用红墨水染色法进行花粉贮藏活力测定。

2.2 花粉贮藏试验

2.2.1 花粉贮藏预试验

未经预处理的花粉，室温中放置1 d后，在显微镜下可明显观察到花粉皱缩开裂，花粉内容物溢出（图1，D），已失去生命力。-12和-20℃环境中保存1 d的花粉，红墨水染色后花粉已全部均匀着色，失去生命力。

从表2看出，未经预处理的花粉，在4℃温度下贮藏，花粉前3天还保持较高生活力，第7天下降比较大，第9天失去生活力。而在0℃温度下贮藏，1 d后就下降较多，但在随后的贮藏时间里（3、7、9 d）下降较为缓慢，第9天还有13.93%的生活力。

表2 不同温度不同时间茵芋花粉生活力测定结果Tab.2 Determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune at different temperature and different time

花粉预试验中，花药未进行一定预处理，室温环境、-12和-20℃环境贮藏1 d均出现花失去活力的情况，而4和0℃环境下花粉均能保持一定时间的活力，图2可看出0℃环境下贮藏1 d就与4℃环境有显著差异，0℃环境下贮藏3 d的活力继续下降明显，4℃环境下贮藏的花粉活力在第7 d开始出现极显著下降趋势，可能由于花粉中水分含量造成了细胞的损伤，说明茵芋花粉贮藏前的预处理是必要的。

图2 不同温度不同时间茵芋花粉生活力测定结果Fig.2 Determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune at different temperature and different time

2.2.2 预处理后花粉贮藏试验

贮藏在室温、4、0、-12、-20℃环境下预处理后的花粉在第1、7、15、30天的花粉活力分别如表3所示。

表3 预处理后不同温度不同时间茵芋花粉生活力测定结果Tab.3 Determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune at different temperature and time after pretreatment

从上表可看出，花粉经预处理后，贮藏在室温、4、0、-12、-20℃环境下的活力在第1天，均能保持较高的活力；7 d后活力下降，各温度间差异并不显著，但在后续的15、30 d中变化有差异；在室温中贮藏7 d开始出现下降，但还是高于50%，而贮藏15 d开始下降，显著低于50%，贮藏30 d仅有19.5%的生活力，对于生产失去一定保存意义。其余试验温度环境下贮藏30 d与贮藏15 d差异均不显著，且生活力均高于50%，对生产上花粉的应用有一定意义。

3 讨论

3.1 花粉活力测定

TTC染色后从20 min开始至48 h观察结束花粉均未染色(无生活力)，造成判断没有生活力的结果，可能是茵芋花粉自身特性(如花粉壁的厚薄，花粉外壁的组成物质，花粉内各种酶活性的强弱等)的影响所致，I2－KI染色结果花粉均染成黄褐色(无生活力)，可能是因为花粉不含淀粉或含淀粉量极低难以检测出来，结果有待进一步研究[17]；若深入研究TTC染色法、I2－KI染色法测定茵芋花粉生活力更多方面的影响条件参数，需要设计更多的影响因素处理组合，如增加不同染色温度、时间组合，设计更多的染色液浓度梯度，并选用同属不同品种等，才能够更详细分析茵芋花粉生活力染色的可信度。

花粉活力最可靠的检测方法还是基于花粉发芽率，即花粉的离体萌发[18]，所以离体萌发试验是现在杂交育种中花粉活力检测的首选方法[8]，从本次红墨水染色法和离体萌发试验法的标准差来看，差异不具有统计学意义，均可适用于茵芋花粉活力测定。并且红墨水染色的效果好，时间快，在某些情况下，可单独使用。而茵芋离体萌发法需在特定温度(25℃)和较长时间(4 h以后)培养才能实现，因而有条件的情况，采用红墨水染色法与离体培养法结合使用，以提高茵芋花粉生活力测定的准确性，同时需要一定的重复试验。

试验离体萌发法的萌发率较低，与花粉最适宜的采集时间，萌发特性，以及茵芋萌发的主因素钙，次因素蔗糖，辅助因素硼等营养的适宜浓度均有关系，此方面研究已另文发表[19]。

3.2 花粉贮藏试验

许多研究表明，花粉活力受贮藏的温度和时间影响较大[20]，同时也受低温贮藏的预处理和解冻方式影响[21-22]。

未经任何处理的茵芋花粉在常温下1 d即变形失去生活力，说明茵芋花粉对温度比较敏感。4和0℃贮藏温度条件下，花粉生活力随着时间的延长而下降。在4℃贮藏条件下，前3 d的生活力差异不显著，到了第7天，生活力下降达到极显著水平，9 d后花粉已全部失去生活力。在0℃贮藏条件下，第1天就下降明显，但在随后的7 d内，花粉活力变化不显著，9 d后变化显著。

在相同的贮藏时间（3 d）下，4℃贮藏条件下的花粉生活力高于0℃贮藏条件下的花粉生活力。而到了7 d，4℃贮藏条件下的花粉生活力低于0℃贮藏条件下的花粉生活力。贮藏时间9 d后，4℃贮藏条件下的花粉已全部失去生活力，0℃贮藏条件下的花粉生活力为13.93%。在本次花粉贮藏试验观察的9 d时间内，4℃贮藏条件下的花粉生活力下降速率更快，从长远的贮藏时间来说，应该探讨低温以及超低温贮藏的方法。

预试验后将花粉经适当干燥并保存在放有干燥剂的指形管中，花粉贮藏活力得到显著提高，室温下的花粉7 d后仍有66.5%活力，15 d后下降明显；而在4、0、-12、-20℃环境下贮藏30 d花粉生活力均高于50%，在生产上杂交育种方面有一定应用。从短期保存上，7 d之内的应用可直接在室温、或放入普通家用冰箱中；30 d之内的应用可放入普通家用冰箱中，冷藏室与冷冻室均可，比较经济实惠；而更长时间(如90 d)的保存与应用，可选择-12、-20℃环境下贮藏[23]，一般花粉保存在低温、低湿和无氧条件下较能保持萌发力，主要原因是降低了呼吸强度和酶的活性。

由于花粉的生活力受遗传特性和贮藏条件的影响，新鲜花粉由于含水量较高，在直接放入低温的环境当中，花粉细胞内的水分容易结成冰晶，从而花粉活力降低[24]。因而花粉采集后必须进行适当水分预干燥处理，再放入低温度下贮藏，保证花粉的活力[25]。本实验中的简单预处理已达到较好效果，但关于茵芋花粉水分预干燥处理的适宜方法与最适含含水量以及合适的解冻方式，可进一步深入研究探讨。