长链非编码RNA GAS5对胰腺癌AsPC-1细胞凋亡、迁移及侵袭能力调控作用

常旭东， 李宏宇， 陈 江， 冯 吉， 李谦谦， 王煜晔， 高 聪， 刘小毓， 高 飞

1.锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁 沈阳 1100162.北部战区总医院消化内科，辽宁 沈阳 110016；3.大连医科大学，辽宁 大连 116000

胰腺癌是恶性程度极高的消化道系统肿瘤之一，病死率较高［1］。在全球工业化国家中，胰腺癌是癌症死亡的第七大原因［2］。据GLOBOCAN 2020估计，仅2020年，全球新增胰腺癌患者495 773例，新增胰腺癌死亡患者466 003例［3］。虽然，目前已经确定了胰腺癌的一些发病危险因素，如吸烟、肥胖、糖尿病、遗传等，但具体发病原因仍不清楚［4］。其早期无明显症状及体征，不易被察觉，绝大多数患者就诊时通常已经是晚期［4-5］。胰腺癌的治疗往往是手术联合放疗、化疗等方式，虽可短暂延长患者的生存期，但总体来看，有效率低，预后较差［6］。5年存活率低至5%～13%［7］。因此，积极探索胰腺癌细胞表型的调控基因是开发新的有效治疗方法的关键。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度＞200个核苷酸的RNA分子［8］。其中，长链非编码RNA GAS5（lncRNA GAS5）被报道为多种癌症的肿瘤抑制因子［8-9］，但是其对胰腺癌细胞系AsPC-1的表型调控情况尚不明确。本研究旨在通过探讨GAS5对胰腺癌AsPC-1细胞的凋亡、迁移及侵袭的调控，为胰腺癌提供潜在的治疗靶点。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胰腺癌细胞株AsPC-1购自中国科学院上海细胞库。细胞在RPMI 1640培养基（购自上海源培生物科技股份有限公司）中添加10%胎牛血清（购自天津康源生物技术有限公司），并在80%～90%的融合条件下传代。所有细胞在5% CO2加湿的环境中维持在37℃。携带GAS5的pcDNA载体（pcDNA-GAS5）由上海基因化工有限公司（中国）构建，用于构建GAS5过表达的胰腺癌细胞系。

1.2 细胞转染及分组 分别将lipo2000 pcDNA3质粒（1 μg／μl）和pcDNA3-GAS5质粒（1 μg／μl）转染至AsPC-1细胞中，将转染pcDNA3质粒的AsPC-1细胞组设为对照组，将转染pcDNA3-GAS5质粒的AsPC-1细胞组设为实验组，将培养瓶置于37℃、 5%CO2孵箱中培养6 h后，使用15% FCS 1640的新鲜培养基换液。将培养瓶置于37℃、5% CO2孵箱中培养42 h，收集两组细胞用于后续实验。

1.3 实时定量PCR 根据生产厂家的说明书，使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）从细胞中提取总RNA。将总RNA应用于cDNA逆转录试剂盒（applied Biosystems）中 检 测GAS5 mRNA。使 用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）检测GAS5 mRNA的相对表达，反应条件为95℃预变性5min，95℃变 性15 s，60℃退 火 和 延 伸1 min，40 个 循 环，β-actin作为内参。特异性引物GAS5序列为正向5′- 3′：GTATGGTGCTGGGTGCG；反向5′- 3′：TAGGCTTGCTCTTTAGGACTT；β-actin序列为正向5′- 3′：GAAGGTGACAGCAGTCGGTT；反向5′- 3′：AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT，由凯杰企业管理（上海）有限公司提供。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 转染48 h后收集两组细胞，进行AnnexinV／PI染色，具体操作步骤按照PE AnnexinV Apoptosis Detection Kit I说明书进行，并通过FACScanto Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司）检测细胞的凋亡率。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力 转染48 h后收集两组细胞，将细胞分别以16 000个／cm2接种至6孔板中，当细胞融合率＞90%时，进行划痕实验。细胞划痕后0 h、24 h、48 h，采用Nikon Eclipse Ti-s显微镜（日本Nikon公司）观察并获取图像，划痕区域面积通过Image J软件进行测量。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力 Transwell上室中加入150 μl稀释后的Matrigel基质胶（美国BD公司），37℃条件下凝固5 h进行基质胶包被。转染48 h后收集两组细胞，分别调整对照组与实验组细 胞密度 为2×105个／ml，各 取500 μl接种至Transwell上室中。下室加入1 ml含20% FBS的培养基。培养24 h后PBS洗涤Transwell上室，用无水冰甲醇固定30 min，PBS洗涤后，用0.4%结晶紫染色20 min，用棉签擦掉上室中未穿过的细胞，采用Nikon Eclipse Ti-s显微镜观察并获取图像。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AsPC-1胰腺癌细胞系转染GAS5基因表达检测 AsPC-1细胞系转染GFP荧光质粒（图1a），明场条件下和荧光条件下均可见目标GFP蛋白阳性的表达，显示转染目标质粒的转染效率良好。转染48 h后收集细胞，以β-actin为内参，行PCR检测。结果显示，实验组的GAS5表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，图1b），表明AsPC-1细胞系成功构建，pcDNA3-GAS5过表达。

图 1 GFP转染及PCR检测（a.GFP转染AsPC-1，上图为显微镜明场下拍照，下图为显微镜荧光下拍照，显微镜倍数100倍；b.GAS5相对表达量检测）

2.2 转染GAS5对AsPC-1细胞凋亡的影响 转染48 h后收集两组细胞，使用Annexin V-FITC／PI凋亡检测试剂盒进行凋亡检测。结果显示，对照组与实验组早期凋亡率分别为（5.1%±2.1%）和（4.8%±2.1%），两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组与实验组晚期凋亡率分别为（6.5%±1.8%）和（6.7%±3.0%），两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图 2 不同转染组细胞流式图凋亡水平［横坐标为FITC，纵坐标为PE；Q1象限：（AnnexinV-FITC）-／PI+为坏死细胞，Q2象限：（AnnexinV+FITC）+／PI+为晚期凋亡细胞，Q3象限：（AnnexinV-FITC）-／PI-为活细胞，Q4象限：（AnnexinV-FITC）+／PI-为早期凋亡细胞］

2.3 转染GAS5对AsPC-1细胞迁移能力的影响 转染48 h后收集两组细胞进行划痕实验，结果显示，对照组24 h的相对划痕面积愈合率为（77.9%±0.5%），高于实验组的（67.7%±0.4%），差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组48 h的相对划痕面积愈合率为（89.8%±0.6%），高于实验组的（77.5%±1.1%），差异有统计学意义（P＜0.05）。GAS5可抑制细胞的迁移能力。见图3。图3 划痕实验检测GAS5对胰腺癌AsPC-1细胞迁移能力的影响（a.划痕实验检测对照组与实验组细胞的迁移能力；b.对照组与实验组细胞相对划痕面积愈合百分率）

2.4 转染GAS5对AsPC-1细胞侵袭能力的影响 转染48 h后收集两组细胞进行侵袭实验，结果显示，对照组侵袭细胞数为（535±28），高于实验组的（314±21），差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，实验组可明显抑制细胞的侵袭能力。见图4。

图 4 GAS5对胰腺癌AsPC-1细胞侵袭能力的影响（a.Transwell检测实验组和对照组细胞侵袭能力，0.4%结晶紫染色，显微镜倍数100倍；b.对照组与实验组细胞侵袭数）

3 讨论

胰腺癌恶性程度高，现有的治疗手段均不能显著延长患者生存期。总体来说，胰腺癌仍缺乏有效的治疗靶点。因此，积极探索胰腺癌新的有效治疗靶点至关重要。随着分子生物学等相关技术的发展，越来越多的学者们开始关注到lncRNA和胰腺癌的关系。lncRNA本身不编码蛋白或只编码很短的多肽，近年来的研究表明，其能够在调节染色质动力学、基因表达、生长、分化方面发挥重要作用［10］。此外，还可通过表观遗传调控等方式影响肿瘤细胞的生长、凋亡、耐药与转移等多个特征性生物学过程［11］。

lncRNA5（GAS5）是近期发现的一种生长停滞特异转录本，其在多种肿瘤发生发展过程中的作用已有多篇文献报道，多数研究认为，GAS5可以抑制人类肿瘤的发生和发展［9，11-12］。但是，GAS5对胰腺癌肿瘤细胞的生物学行为的影响尚未完全清楚。Gao 等［13］研究发现，GAS5能够通过miR-181c-5pt调控Hippo通路，影响胰腺癌对化疗药物的耐药性。Lu等［14］研究表明，GAS5还可以通过调节蛋白激酶6的表达水平在一定程度上抑制胰腺癌细胞增殖。为了进一步研究GAS5对胰腺癌肿瘤细胞生物学相关功能的作用与影响，本研究将GAS5质粒转染胰腺癌AsPc-1细胞株，流式细胞学检测结果示，GAS5转染对胰腺癌AsPC-1细胞凋亡无显著影响。而Gao等［15］的另外一项研究发现，GAS5可诱导胰腺癌细胞凋亡。笔者推测这与本研究选择的细胞系不同有关。Gao等［15］选择的细胞系为PANC-1、BxPC-3等，其恶性表型与AsPC-1细胞不同。另外，也可能与凋亡检测时间点不同有关。后续笔者拟通过增加纳入研究的胰腺癌细胞系种类对GAS5转染后胰腺癌细胞凋亡的变化情况进行进一步研究，以明确GAS5对胰腺癌肿瘤细胞生存的影响。本研究细胞划痕实验和Transwell实验结果显示，转染GAS5对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力抑制明显。该结果与Liu等［16］报道的体内过表达GAS5可以抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力的结果相类似。这提示GAS5在不同类型肿瘤中可能存在相似的调控作用，需要进一步研究其作用机制。

综上所述，lncRNA GAS5对胰腺癌AsPc-1细胞凋亡无明显影响，对其迁移、侵袭能力有明显的抑制作用，这可能为胰腺癌的治疗提供新的靶点。