斑马鱼模式生物在发育生物学实验教学中的应用

谢尚论，王春景，李 晶，胡 珂，刘高峰 (蚌埠医学院生命科学学院生态学教研室， 蚌埠 233030)

发育生物学是在细胞生物学、生物化学与分子生物学、遗传学和组织胚胎学等学科的基础上发展起来的一门前沿学科，研究生物体组织器官的发生发育模式、细胞稳态、组织细胞损伤修复和再生过程以及其中的分子调控机制[1]。高等脊椎动物从单个细胞发育而来，经过卵裂、胚胎发生、细胞分化、细胞组装成组织器官等事件最终成为复杂的多细胞生物体。其中每个过程都是高度动态的，任何一个环节信号调节出现问题都会造成胚胎发育畸形，导致组织器官功能异常，进而引发相应的疾病发生。学习发育生物学的知识可以直接帮助我们了解生物体进化和发育调控的分子机制以及许多先天性和后发性疾病的病理机制，为组织工程和再生医学的发展，乃至细胞和基因治疗提供理论基础。

随着近年来实验技术的进步，发育生物学的内容也在不断更新，然而发育生物学的实验课程发展相对缓慢。受限于实验教学条件，许多普通本科院校未开设或开设很少的发育生物学实验课程，实验内容大多是对简单模式生物胚胎发育过程的观察，组织器官的观察也仅限于购买商业切片，留给学生设计和操作的空间不多，这对于培养学生的动手实践能力和科学兴趣是不利的[2]。实验教学与课堂理论教学相辅相成，学生用自己的实验结果验证课堂中学习的理论知识，通过对实验结果的分析与讨论，思考实验设计和操作步骤中的不足之处，并提出改进方案。这对于激发学生的主观能动性，提高学生分析与解决问题的能力有促进作用[3]。为了实现教学-科研一体、培养综合性高素质人才的目标，自2020年下半年起，我们对生物科学、生物技术专业三年级的本科生开设发育生物学实验课程。

课堂教学中，我们选用的教材为张红卫主编的《发育生物学》第四版[4]。在2019年教学大纲修订中，我们增加了脊椎动物眼的发育这一章的教学内容。眼是脊椎动物获取外界信息的主要器官之一。就人类而言，眼的视觉功能对人类生产生活十分重要。除此之外，眼睛是人类面部较为突出的器官，一双好看的眼睛可以很大程度上提升人的相貌，因此，发育完好的眼睛还能提升个人的生活幸福指数。随着我国经济社会的快速发展，人工照明设备使用的范围逐渐扩大，光照强度也逐渐增强，光污染正严重威胁着人类眼的健康。近年来，白内障、视网膜退变和视神经萎缩等眼科疾病的发生率也在提高[5]。学习眼的发生发育过程以及其中的分子调控机制对医学院校学生保护眼睛和将来从事临床眼科疾病的治疗工作都是有帮助的。为了配合脊椎动物眼的发育这一章的教学内容，经过详细的研判，我们认为模式生物斑马鱼适合用来作为实验材料，开设观察视网膜分层发育、晶状体纤维细胞去核和视神经发育过程的综合性探索实验[6]。

1 实验教学设计

1.1 实验原理

成熟的脊椎动物视网膜最开始从一层均质的神经上皮细胞分化而来，是由五种神经细胞和两种非神经细胞(视网膜色素上皮细胞和神经胶质细胞)精巧排列的三核层结构。一般而言，视网膜细胞发育过程可大致分为三个阶段。第一阶段是神经节细胞层生成，发生在胚胎受精后24-36 h，位于视网膜内侧、靠近晶状体的神经节细胞开始分化。此时，视网膜分为两个核层；第二阶段是内核层形成，发生在胚胎受精后36-48 h，包括无长突细胞、水平细胞和双极细胞在内的中间神经元开始分化。此时，视网膜呈三核层结构；第三阶段是外核层形成，发生在48-72 h，感光细胞(视杆细胞与视锥细胞)开始分化，位于视网膜最外侧。神经胶质细胞最后分化，横跨三个核层。晶状体发育时，晶状体泡后部的初级纤维细胞向晶状体腔生长，前部的上皮细胞向两侧赤道部迁移，分裂增殖产生次级纤维细胞。两种纤维细胞在成熟时需要经历去核与去细胞器过程，使细胞变得透明。视神经发育时，神经节细胞的轴突汇聚成一束，通过视柄与间脑连接，将视网膜里的信息传递给视觉中枢。视神经上没有感光细胞，是生理盲点，外核层感光细胞在视神经处不连续，从形态结构上可以辨认[7,8]。

冷冻切片技术操作简单、快捷，是用作观察胚胎发育过程中组织器官形态变化过程最常用的技术之一。DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)是一种与DNA强力结合的核酸荧光染料，在荧光显微镜下用紫外光激发可发出蓝光。学生在胚胎发育的不同时期收集斑马鱼幼鱼，制作视网膜冷冻切片，通过DNA DAPI染色标记细胞核，可以在荧光显微镜下观察不同发育阶段视网膜分层情况、晶状体纤维细胞去核化过程和视神经的位置与形态特征。

1.2 教学目的

教学目的是使学生掌握成年斑马鱼的饲养、配鱼和收卵等操作；使其学会制作视网膜冷冻切片，掌握DNA DAPI染色技术的原理和实验操作方法，观察脊椎动物视网膜分层发育、晶状体纤维细胞去核以及视神经形成的过程与形态特征，以辅助脊椎动物眼的发育这一章的课堂教学；锻炼本科生的实验设计与操作能力，培养科研兴趣爱好。

1.3 教学的重点与难点

教学重点是让学生学习并掌握动物组织冷冻切片与DNA DAPI染色技术的原理与实验操作，对脊椎动物视网膜分层发育、晶状体纤维细胞去核和视神经发育的过程以及每个时期的组织形态有一个清晰整体的认识。

教学难点是本实验中用到的是胚胎受精后24-72 h的斑马鱼幼鱼，对这些幼鱼眼球做纵切片、染色和拍照有一定的难度。有些操作学生或许不能独立完成，需要在教师的指导下进行。

2 实验材料与设备

2.1 实验动物

实验动物为野生型AB品系性成熟的成年雌雄斑马鱼。

2.2 实验试剂

实验试剂包括：胚胎水，pH值为7.2的含有5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl、0.33 mmol/L MgSO4和0.1%(体积比)亚甲基蓝的盐溶液；组织固定液，4%的多聚甲醛；脱水试剂，30%的蔗糖溶液；包埋剂，OCT透明胶；DAPI染色液；封片剂，含50%甘油的PBS溶液；固片剂，普通指甲油。

2.3 实验仪器

实验仪器包括：低温切片机，Leica CM1950；荧光显微镜，Obsever Z1；体视显微镜；37 ℃培养箱，上海精宏仪器公司GNP-9050。

3 教学安排

3.1 学生分组

为了使每个学生都能充分参与实验，我们采用小班教学的方式进行本实验。2-3人一组，小组成员协作完成实验任务。根据学生实际操作情况，由学生完成全部或者其中部分实验在教师的指导下完成。

3.2 实验试剂与材料准备

实验试剂的准备与配制：本实验购买商业化的4%多聚甲醛溶液、OCT包埋剂、DAPI染色液(上海碧云天生物公司，C1006)和普通指甲油，需要自己配制的溶液有胚胎水、30%蔗糖脱水溶液(质量体积比，30克蔗糖溶于100毫升双蒸水中)和含50%甘油的PBS溶液。

不同发育阶段的斑马鱼幼鱼的收取：性成熟的雌雄AB品系斑马鱼在28.5 ℃的恒温养殖系统中饲养，学生每天按14 h光照、10 h黑暗处理，一天喂食三次丰年虫。前一天晚上喂食过后1 h，学生按雌雄1∶1或1∶2的比例配鱼，第二天上午光照半个小时后拔开挡板，让雌雄鱼混合产卵；收的卵中加入胚胎水，置于28.5 ℃的恒温生化箱中培养，注意换水并挑出死胚胎。本实验中用到胚胎受精后24-72 h的幼鱼，此时的幼鱼不需要喂食。学生分别收集胚胎受精后不同发育时期的幼鱼，用4%多聚甲醛溶液固定过夜，然后用30%蔗糖溶液脱水，直到幼鱼沉到试管底部。

3.3 制作视网膜冷冻切片

整条幼鱼用OCT胶包埋在冷冻底座上。学生包埋时让鱼头朝前，鱼尾朝向自己，鱼背朝上，鱼腹朝下，尽可能使鱼身体左右两侧保持水平，这样切出来的视网膜纵切片效果比较好。包埋好的幼鱼放在冰冻切片机的箱体中(-25 ℃)冰冻固定15 min，然后学生开始切片。学生设定切片厚度为6-8 μm，在体视显微镜下观察是否切出理想的观察视网膜、晶状体和视神经形态的片子；切好的片子粘贴在防脱载玻片上，并在37 ℃培养箱中烘干20 min。此时的玻片可以直接用于DAPI染色，也可以放于-20 ℃冰箱中保存。

3.4 DAPI染色

学生从-20 ℃冰箱中取出的切片先室温平衡20 min，再用超纯水润洗2次，每次5 min，去除载玻片上多余的OCT胶；润洗结束后用纸巾擦干切片上多余的水份，注意不要擦掉视网膜与晶状体组织；在切片的空余地方滴加稀释后的DAPI染色液，使组织完全浸没，室温避光静置染色5 min，去除染色液，用PBS润洗2次，再加入20 μL左右的封片液覆盖组织，小心盖上盖玻片，用指甲油沿盖玻片边缘封片；最后将做好的切片放在暗盒中4 ℃保存。

3.5 荧光显微镜观察与拍照

学生用蔡司荧光显微镜观察染色结果并拍照，实验结果如图1所示。在胚胎受精后28 h，视网膜细胞未分层，此时的视网膜细胞没有开始分化，还具有有丝分裂能力。学生在晶状体中清晰可见初级与次级晶状体纤维细胞核(图1A)。胚胎受精后36 h，在视网膜的内侧、中央靠近晶状体的位置分成两层，此部位的神经节细胞首先分化，此后神经节细胞由视网膜中间区域逐渐向两侧远端分化。晶状体纤维细胞去核程序尚未启动(图1B)。胚胎发育到48 h，内核层的神经节细胞已经基本分化完成，靠近鼻侧视网膜的内核层细胞也开始分化，此时鼻侧视网膜呈现清晰的三层结构，而颞侧部分内核层细胞分化尚不完全，三层结构不清晰或仍保持两层结构。此时，晶状体初级纤维细胞已经完成去核，而次级晶状体纤维细胞去核尚未开始(图1C)。到72 h，内核层的中间神经元基本完成分化，外核层的感光细胞也开始分化，此时视网膜整体上呈现清晰的三层结构。晶状体中次级晶状体纤维细胞开始去核，视神经结构清晰可见(图1D)。

图1 不同发育时期的斑马鱼幼鱼视网膜、晶状体和视神经DAPI染色

4 思考与讨论

我们认为模式生物斑马鱼适合作为生物材料开设发育生物学实验课程，以观察脊椎动物视网膜分层发育、晶状体纤维细胞去核和视神经发育的形态变化过程。实验过程中，小组的每个学生都能积极地参与实验，尤其对斑马鱼饲养、配鱼、收卵、切片和染色等操作感兴趣。该小组的实验结果整体上非常好。从28 h到72 h，学生能看到视网膜由一个单一核层逐渐发育为三个核层的过程，也能看到初级与次级晶状体纤维细胞随发育进程的去核化过程，在72 h的视网膜切片中更清楚地观察到视神经结构。实验结果与教材内容完全一致，这对于学生加深理解课堂教学内容、培养实验热情和科研素养有重要意义。

本实验中有两点可以改进的地方：①学生在包埋环节幼鱼没有完全水平放置，导致左右眼睛切片的位置有些不对应，如在48 h与72 h的切片中，右侧眼睛的视网膜与晶状体切片位置与左侧不对应；②收取幼鱼的时间点可以再增加一些，如36 h与48 h之间增加一个42 h，48到72 h之间增加一个60 h，以便更细致地观察视网膜分层、晶状体纤维细胞去核以及视神经发育的过程。

本实验用到的都是常规仪器设备，操作难度适中。没有斑马鱼养殖系统的院校可以直接从国家斑马鱼资源中心购买受精卵。斑马鱼受精卵体外发育，早期不需要特殊照顾，因此，几乎所有院校都能开设本实验。另外，教师还可以根据自己的学时情况，在本实验的基础上进行延伸，如针对教材中视网膜不同类型细胞的分化受到不同转录因子调控的内容，收取不同发育时期的幼鱼，提取RNA做反转录，以cDNA为模板、设计荧光定量PCR引物，检测转录因子编码基因pax6、otx2、与rax随时间的动态表达情况，以加强学生对视网膜细胞分化调控分子机制的理解。