基于网络药理学和数据挖掘探讨中药干预细胞因子风暴的物质基础及用药规律

陈 琛，周海龙，吴春兴，王博龙

1宜春学院；2宜春市第二人民医院，宜春 336000

细胞因子是机体产生炎症反应不可或缺的一部分，而细胞因子风暴(cytokine storm，CS)是机体感染病原微生物后IL-6、IL-1、TNF-α、IFN等多种细胞因子在短时间内异常增高表达所导致的严重免疫反应，被认为是新冠肺炎发展的主要机制之一[1]。临床研究[2,3]显示部分新冠肺炎患者早期症状较轻，而后期病情突然加重的主要原因是CS，且严重程度与CS呈正相关。对于危重病人，CS可诱发急性呼吸窘迫综合征和多器官损害，甚至死亡。由于CS的发生机制相对复杂，导致与之相关的疾病也进展迅速，为临床治疗带来了挑战。因此，近年来CS干预调节剂的研发已成为热点课题。

传统中医药在疾病的临床治疗中疗效显著，且中药复方干预疾病时具有多靶点、多途径、安全性高等优点。网络药理学研究方法能整合疾病靶点、成分、中药等具有联系的重要信息；本研究拟采取网络药理学方法并结合数据挖掘，以CS相关靶点为切入点，探讨中药干预CS的物质基础及一般规律，以期为中药干预CS的相关研究和实验验证提供借鉴和参考。

1 资料与方法

1.1 相关靶点收集

以“cytokine storm”为关键词，借助GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca)、OMIM数据库(https://omim.org)收集相关靶点。合并去重后利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)匹配靶点全称。

1.2 化合物筛选及靶点-化合物网络构建

基于中医药系统药理学平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，同时根据CS相关靶点全称匹配化合物。化合物应满足如下条件[4]：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥18%、半衰期(half-life，HL)>4、拓扑极性表面积(topological polar surface area，TPSA)<140、可旋转键数(number of rotatable bonds，RBN)≤10、分子质量(molecular weight，MW)≤500 Da。借助Cytoscape 3.7.2软件构建靶点-化合物网络，并利用Network Analyzer插件分析各节点的拓扑属性值。

1.3 中药获取及靶点-化合物-中药网络构建

借助TCMSP数据库获取包含备选化合物的所有中药；去重后根据《中药学》[5]、2020版《中华人民共和国药典》规范中药名称，如“川牛膝”统一为“牛膝”“南蛇藤果”规范为“合欢花”等。因化合物在靶点和中药间起桥梁作用，故可借助化合物映射得到靶点所对应的中药。利用Cytoscape 3.7.2软件构建靶点-化合物-中药网络可视图，通过分析该网络中各节点的拓扑属性值，找出关键节点，初步评估各中药及其化合物干预CS的功效强度[6]。

1.4 分子对接验证

分子对接可验证潜在靶点与备选化合物间的作用可信度，亦能为新的化合物-靶点组合提供思路。本研究选取靶点-化合物网络中度值排名前七位的靶点与度值较高的化合物进行分子对接。在PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)下载各蛋白的晶体结构，保存为.pdb格式；借助PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)保存化合物的2D结构，格式为.SDF。CB-Dock在线分子对接平台(http://clab.labshare.cn/cb-dock/)可自动识别上传蛋白的潜在结合位点，并使用内置的Auto Dock Vina软件进行分子对接[7]。对接得分值(affinity)可衡量潜在靶点与备选化合物间的作用可信度，得分<-1.67 kJ/mol表示两者间具有更强的结合活性。Ligplot软件(Version 2.2)可自动计算受体与配体间形成的氢键、疏水作用或结构比对，将Affinity值最好的对接组合导入该软件进行2D可视化展示。

1.5 中药性味归经功效分析

参照《中药学》和2020版《中国药典》规范已匹配中药的性味、归经、功效等基本信息，若某味中药有多种性味归经，则分别统计在内。此外，如中药性味中出现“微寒”“微苦”等则统一归为“寒”“苦”。将匹配靶点较多的中药与其性味、归经、功效建立联系，利用Cytoscape 3.7.2软件构建中药性味归经功效网络。

2 结果

2.1 相关靶点结果

结果从GeneCards和DrugBank数据库各获得638、89个与CS相关的基因靶点，其他数据库没有检索到相关靶点。筛选GeneCards数据库中靶点值较高(relevance score>6)的前100位相关靶点，去重后经UniProt数据库规范共获得113个CS相关基因靶点。经筛选匹配，只有35个靶点存在符合条件的对应化合物，故将这35个靶点定义为干预CS的潜在靶点(见表1)。

表1 潜在靶点基本信息

2.2 备选化合物筛选及靶点-化合物网络构建

在TCMSP数据库中以“潜在靶点”为检索词，以OB≥0.3、DL≥0.18、HL>4、TPSA<140、RBN≤10、MW≤500 Da等为条件筛选潜在靶点对应的备选化合物，合并去重后共获得49个CS潜在靶点对应的备选化合物，图1为靶点-化合物网络。该网络由84个节点和136条边组成，图中箭头节点代表潜在靶点，八边形节点为备选化合物。节点度值越大其枢纽作用越强，在网络中的作用越重要。可见度值前5位的化合物依次是槲皮素、木犀草素、雷公藤甲素、漆黄素、汉黄芩素，它们分别对应着23、13、10、9、7个靶点。另外，度值前7位的靶点依次为MAPK14、TNF、IL6、AKT1、MAPK1、VEGFA、IL1B。

图1 靶点-化合物网络图

2.3 中药获取及靶点-化合物-中药网络构建

借助TCMSP数据库匹配出49个备选化合物涉及的全部中药，去重后根据《中药学》、2020版《中国药典》规范中药名称并去重，最终获得268味中药。利用Cytoscape 3.7.2软件构建化合物-中药网络，该网络包含317个节点和589条边。经Network Analyzer拓扑分析，度值在前十位的中药依次是甘草、苦参、鸡血藤、胡芦巴、山豆根、射干、灯盏细辛、银杏叶、菊花、败酱草，分别对应着12、10、8、7、7、6、6、6、6、6个备选化合物。同时，银杏叶、败酱草、甘草、灯盏细辛可分别作用于29、29、29、28个靶点，故推测这四味中药对CS具有较强的干预作用，可作为临床遣方用药或实验研究的重点；中药度值及其对应的靶点数见图2。由于化合物-中药网络的度值中位数为2，因此认为度值>4的化合物为干预CS的潜在核心化合物，共15个(见表2)。度值较高的前5位化合物分别是槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素、柚皮素。本研究选取度值>4的中药，利用Cytoscape 3.7.2软件重新构建靶点-化合物-中药网络图(见图3)，其中网络节点的大小与其度值成正比。

图2 中药度值及其作用靶点数分布图

图3 靶点-化合物-中药网络图(Degree>4)

表2 干预细胞因子风暴的潜在核心化合物(Degree>4)

2.4 分子对接

利用CB-Dock在线分子对接平台将度值前15位的化合物与7个核心靶点MAPK14(PDB ID:4EH3)、TNF(PDB ID:6M8A)、IL-6(PDB ID:5Z15)、AKT1(PDB ID:1QKM)、MAPK1(PDB ID:3V3V)、VEGFA(PDB ID:4GQR)、IL1B(PDB ID:5R86)进行分子对接，结果见图4。在105组对接结果中，affinity值<-1.67 kJ/mol的有95组(90.48%)，其中对接affinity值最高的组合为IL-6-luteolin(-2.56 kJ/mol)，最低的是IL1B-matrine(-1.48 kJ/mol)。利用Ligplot软件将affinity值最高的5组对接组合结果以二维图的形式展示，如图5A～5E所示。可见各配体均嵌入靶点蛋白的活性口袋中，且通过疏水作用或氢键等形式与靶蛋白的多个氨基酸残基发生相互作用。

2.5 性味归经功效分析

根据《中药学》与2020版《中华人民共和国药典》匹配所获得中药的基本信息，建立数据库，其中对应靶点较多的中药基本信息见表3。利用Microsoft Office Excel 2017表的数据透视表功能统计分析中药的性味归经，干预CS的中药药味总频次为393次，以苦为主；药性总频次为264次，以寒最常见(见表4)。同时，这些中药以入肝经(137次)、肺经(107次)最多(见图6)。由此推测CS的发生机制可能与肝经、肺经有着紧密的联系。将对应靶点最多的前15位中药与其性味、归经、功效建立联系，并构建中药性味归经功效网络。由图7可知这些中药的特征与上述分析结果基本吻合；此外，它们在功效分类上多为清热类、活血化瘀类、补虚类。

图6 归经分布图

图7 中药性味归经功效网络图

表3 主要中药基本信息

表4 干预细胞因子风暴的中药性味分布

3 讨论

CS是人体受刺激后产生的过度免疫反应，体内的细胞因子、趋化因子被活化释放，导致促炎和抗炎的平衡被打破。研究[8]表明导致COVID-19患者病情恶化、死亡的罪魁祸首正是CS，而抑制CS是抢救危重症COVID-19患者的首要任务。西医治疗CS主要依赖糖皮质激素，长期大剂量使用糖皮质激素虽能达到一定的防治效果，但其所带来的毒副作用不容忽视。与之相反，中药本身具有作用广泛、靶点多元、整体调节等优势，在干预和调节CS中具有广阔的应用前景和研究价值。本研究借助网络药理学和数据挖掘的方法，以CS相关靶点为切入点，筛选出干预CS的化合物和中药，并系统预测和阐释了中药干预CS的物质基础及用药规律。

结果显示，度值排名靠前的靶点主要有MAPK14、TNF、IL6、AKT1、MAPK1、VEGFA、IL1B等。丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)在细胞增殖、分化、炎症反应、免疫防御等诸多方面发挥着重要作用。研究[9,10]表明MAPK14在调节细胞因子(TNF-α、IL-6)和趋化因子(CCL2、CCL4)等方面发挥关键作用，调节MAPK14的活化可抑制细胞炎症因子的释放。COVID-19患者感染早期TNF-α、IL1B等早期炎症因子即迅速分泌，过量的早期炎症细胞因子会打破体内抗炎-促炎平衡，进一步引发包括IL-6、IL-2等在内的细胞因子和趋化因子活化、释放，形成失控的CS[11]。另外，由于TNF-α是机体在炎症早期分泌的主要炎性因子，可使细胞间黏附分子表达增加，NF-κB活性增强，最终通过正反馈调节机制使炎症反应扩大和持续[12,13]。IL-6不仅具有多种生物学活性，且是前炎症介质[14]；同时IL-6的体内水平与COVID-19患者病情程度呈正相关，这预示着其在中药抗炎反应中可能处于关键地位。此外，广泛分布于脑中的VEGFA作为重要的血管生成因子，可能通过促进炎症细胞的聚集及调节血管生成素II(Ang II)的水平在COVID-19患者脑部炎症中起关键作用[15]。

靶点-化合物网络中对应靶点较多的化合物，如雷公藤甲素、漆黄素等所映射的中药在后续分析中度值较小，故不再讨论。而度值较高的化合物主要有槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素、柚皮素等。研究[16]显示槲皮素可通过抑制NF-κB p65蛋白表达，降低IL-6等炎症因子的分泌，从而发挥抗炎及保护血管内皮细胞的作用。山奈酚能显著抑制MAPK通路的激活，降低IL-8、IL-10、MDC等炎症因子产生，从而有效抑制炎症发生[17]。Leyva-López等[18]研究证实木犀草素是重要的促炎细胞因子调节剂，可抑制炎症反应中的活性氧和一氧化氮(NO)等介质，减少细胞因子的表达和分泌。此外，柚皮素可通过抑制LRP3炎症小体活化，进而降低肺组织中TNF-α、IL-1B和IL-18等炎症因子的含量[19]。分子对接结果显示所筛选的高度值化合物与核心靶点间均具有较好的结合活性；此外，黄芩素、芦荟大黄素等化合物在分子对接中也展现出了较好的对接活性。

靶点-化合物、靶点-化合物-中药等网络直观呈现了中药在干预CS方面具有多种类、多成分、多靶点的特点。同时，化合物度值及对应靶点数也体现了银杏叶、败酱草、甘草等中药在干预CS上的重要性。实验证实银杏叶及其提取物可干预小鼠Ghrelin-Obestatin信号通路，降低血清中TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子含量，减轻炎症反应、改善肺功能[20]。败酱草可降低炎症模型大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的含量[21]，且具有清热解毒的功效，是疏风解毒胶囊的主要佐药[22]。Dai等[23]发现甘草、菊花、射干等是新冠肺炎治疗的常用中药，这些中药均能较好地抑制TNF-α、IL-6等细胞因子的产生。由甘草、射干等中药组成的清肺排毒汤作为新冠肺炎治疗的主要方剂，能显著降低促炎因子释放，具有强大的体内外抗炎活性[24]。苦参碱作为苦参的主要成分，其治疗新冠肺炎的临床疗效已得到证实；此外，苦参中含有的黄酮类化合物也具有明显的抗炎活性，能显著抑制促炎性细胞因子NO、TNF-α、IL-6及MCP-1等释放[25]。

性味分析显示具有干预CS潜能的中药药味以苦为主，药性以寒最常见。中医理论认为苦味中药“能泄、能燥、能坚”；且多具有清泄火热、泄降气逆、通泄大便、泻火存阴等功效。CS引起的急性肺损伤患者多有燥热内结、腑气不通、腹胀痞满等症候，苦味中药之应用可发挥通气泻下、廓清热邪的作用。寒性中药多有清热解毒、泻火凉热之功效，而CS所致的COVID-19属中医“温热病”范畴，主要表现多为发热、咳嗽等，应用寒性中药正符合中医热者寒之的基本治则。与此同时，具有干预CS潜能的中药多入肝经、肺经，肝为将军之官，肺为机体宣发肃降之脏。《素问·阴阳应象大论》有“肺居膈上，其气肃降；肝居膈下，其气升发；肝升才能肺降，肺降才能肝升”的记载，可见只有肝肺两脏升降相宜才能保证人体气机舒展气血正常运行，进而恢复患者的呼吸功能。由此可见，中医药干预CS可从清热泻火、活血化瘀及补益肺气等方面入手。

综上所述，本研究利用网络药理学、分子对接和数据挖掘等方法，以CS相关的靶点为切入点，较为系统地探讨了中药干预CS的潜在药效物质基础及其用药规律。在一定程度上为中医药干预CS及其相关疾病提供了理论支持，也为进一步开发干预CS的药物提供了新思路。