松花粉对环磷酰胺致卵巢早衰大鼠的卵巢保护作用

何毓婕，曲 涛，王 桐，何志勇，王召君，秦 昉，曾茂茂，陈 洁*

1江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122；2烟台新时代健康产业有限公司，烟台 264000

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指卵巢功能衰竭所致的40岁之前闭经的现象，其特点是促性腺激素水平的升高和雌激素水平的降低[1]，卵巢早衰还可能导致不孕等临床症状。POF的发生率约为1%～3%，且有逐渐升高和年轻化的趋势[2]。多种因素可诱发POF，如环境因素、遗传因素和疾病因素等[3]。因此，POF的预防和治疗受到了全社会的广泛关注。

目前，POF常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)，如使用天然雌激素雌二醇或孕激素黄体酮等[3]。在肿瘤患者中，促性腺激素释放的激素类似物也被证明在预防化疗引起的POF具有较好的效果[4]。然而，使用激素替代疗法可能会带来更高的罹患乳腺癌、中风和胆囊疾病风险[5,6]。众所周知，中草药特别是传统的药食两用材料具有很高的安全性。有研究表明，中草药治疗比HRT治疗在降低FSH水平方面具有更好的效果[7]。因此，开发基于药食同源的更加安全有效的卵巢保护产品对于维护人民身体健康具有重要意义。

松花粉是马尾松或油松等几种同属植物的雄性生殖细胞，含有蛋白质、氨基酸、酶、维生素、矿物质、核酸、黄酮、多糖、胆碱、植物甾醇等200多种营养和活性物质，被报道具有保护肝脏、增强免疫力和抗肿瘤作用[8]，以及减少炎症反应和氧化应激的能力[9]。此外，松花粉也被证实具有保护前列腺的作用[10]，这表明其可能具有保护生殖系统的能力。松花粉中多糖的含量较高，且其结构与枸杞和当归多糖相似，而枸杞多糖[11]和当归多糖[12]被报道具有卵巢保护特性。松花粉中还含有大量柚皮素[13]，而柚皮素被认为具有雌激素样作用，可以与雌激素受体结合以维持生理功能[14]。因此，松花粉具有卵巢保护的潜力，但目前松花粉的功能研究很少涉及到卵巢保护。

本文采用环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)诱导建立POF大鼠模型，灌胃高中低3种剂量的松花粉悬液，研究松花粉对卵巢形态、血清激素水平、炎症因子浓度、卵巢抗氧化酶活性以及抗颗粒细胞凋亡的作用及可能机制，以期为基于卵巢保护的松花粉功能性产品的开发提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及环境

SD大鼠(雌性，10周龄，体重约250 g)，浙江维通利华实验动物技术有限公司，许可证SCXK(浙)2019-0001，饲养于温度20～26 ℃，湿度55%～70%，照度15～20lx的屏障设施内，每笼4只，照明时间为每天12 h，期间自由进食饮水。

1.2 药品与试剂

破壁云南松花粉(新时代健康产业(集团)有限公司)；环磷酰胺一水合物(Cyclophosphamide monohydrate)(美国Sigma公司，批号为：WXBD0060V)；红丽来结合雌激素片(新疆新姿源生物制药有限责任公司，批号为：20200404)；大鼠雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、抗苗勒试管激素(anti-Muller tube hormone，AMH)、抑制素B(Inhibin B，INHB)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)Elisa试剂盒(武汉伊莱特生物科技股份有限公司，批号分别为：X2EMIUXXF8、ISDMZHEPUL、DPGZG43U1U、QVZHNJPL6W、J2W5 REJ4J2、XDUTTUKQH7、F5W496GZSQ、V8TD13EG W9)；总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活力、过氧化氢酶(catalase，CAT)活力测定试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、伊红-苏木素(hematoxylin and eosin，H&E)染色试剂盒，一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)(上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为：S0119、S0101S、S0056、S0051、P0010S、C0105M、C1088)；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗体(英国Abcam公司，批号分别为：GR3275117-9、GR249198-97、GR3241586-15)；Cleaved Caspase-3抗体(美国CST公司，批号为：47)。

1.3 仪器与设备

SpectraMax190酶标仪(美国分子仪器公司)；GZP-150N光照培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；3K15冷冻离心机(美国Sigma公司)；XB70雪花制冰机(美国Grant公司)；SB5200超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)；IKA VORTEX 3旋涡混匀仪、C-MAG HS7磁力搅拌仪(德国IKA仪器有限公司)；Spectra MAX 190酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Leica ASP300S型全自动脱水机、Leica RM2255型半自动切片机、Leica TS5015型全自动染色机(德国徕卡仪器有限公司)；奥林巴斯BX51型光学显微镜(日本奥林巴斯光学仪器设备有限公司)；Trans-Blot Turbo半干转印系统、164-5050基础电源电泳仪、165-8003小型垂直电泳槽(美国伯乐公司)；iBright FL1500成像系统(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、造模及给药

取雌性SD大鼠48只，体重250 ± 10 g，适应性喂养1周后，随机分为6组，每组8只，分别为空白对照组、卵巢早衰模型组、阳性药物对照组、松花粉高、中、低剂量组。空白对照组腹腔注射生理盐水，其余组均腹腔注射环磷酰胺(第1天60 mg/kg，后14天10 mg/kg剂量)造模，造模期间每天刮取阴道分泌物制作阴道涂片观察动情周期，动情周期紊乱或者延长则视为造模成功，造模成功的大鼠纳入后续实验。实验组分别连续28天灌胃高(1.5 g/kg)、中(0.5 g/kg)、低(0.1 g/kg)不同剂量的破壁松花粉，阳性对照组灌胃结合雌激素溶液(0.075 g/kg)，空白对照组及模型组灌胃生理盐水。每周记录大鼠体重变化，末次给药后大鼠禁食12 h，异氟烷吸入麻醉后腹主动脉取血，于4 ℃条件下3 000 r/min离心15 min，取上层血清用于激素和炎症因子的测定。取出卵巢组织，剔除脂肪后称重，计算卵巢指数。称重后的卵巢一部分用4%多聚甲醛固定用以后续的病理切片，另一部分采用液氮速冻后置于-80 ℃备用，用于抗氧化和抗凋亡指标的测定。本实验方案经江南大学实验动物中心伦理委员会批准实施，审批号为JN.No20201030S1201203[272]，所有动物实验操作符合江南大学动物管理与使用委员会的规定(SYXK2012-0002)。

1.4.2 卵巢指数计算

卵巢指数的计算公式如下：

卵巢指数(g/100 g)=

单个卵巢重量(g)/大鼠体重(g)×100

(1)

1.4.3 卵巢组织病理学观察

4%多聚甲醛固定的卵巢使用梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续切片，苏木精伊红染色后，于光学显微镜下观察卵巢组织的形态学变化，观察内容包括卵巢的始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡及黄体数的变化及卵巢皮质、髓质、卵母细胞、颗粒细胞和细胞间质等病理改变。

1.4.4 血清中激素和炎症因子水平的测定

采用酶联免疫吸附分析(Elisa)试剂盒测定血清中的E2、P、LH、FSH、AMH、INHB、TNF-α和IL-4等激素和炎症因子水平，所有实验操作均按照试剂说明书进行。

1.4.5 颗粒细胞凋亡水平的检测

采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)试剂盒测定卵泡周围颗粒细胞的凋亡水平，具体步骤严格按照说明书进行。操作完成后于荧光显微镜下拍摄清晰照片，随机选取5个最高视野用于凋亡细胞计数和凋亡指数计算。

凋亡指数计算公式如下：

凋亡指数=凋亡细胞/细胞总数×100%

(2)

1.4.6 卵巢组织中T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT的测定

采用商业化试剂盒测定卵巢组织中SOD、GSH-Px、CAT的活力和T-AOC水平，所有实验操作严格按照说明书进行。

1.4.7 卵巢组织凋亡因子的表达

采用蛋白质印迹(Western blot)法测定卵巢组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved Caspase-3四种凋亡因子的表达。将冷冻的卵巢在冰上剪切，然后在RIPA裂解缓冲液(含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)中匀浆，静置30 min。裂解液以14 000 r/min离心10 min，用BCA蛋白定量试剂盒测定上清液的蛋白浓度。在上清液中加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液，沸水煮10 min，将煮沸的样品进行电泳分析。使用半干转印系统将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜置于封闭液中，室温封闭2 h。封闭后PVDF膜用TBST洗涤3次，加入不同的一抗(见表2)，4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔)室温孵育1 h。用TBST洗涤3次后，将ECL化学显色液均匀滴在PVDF薄膜上，用化学发光成像系统检测发光强度并用ImageJ进行灰度值分析，以β-actin为内参计算四种凋亡蛋白的表达水平。

1.4.8 数据处理

数据用平均值±标准偏差表示，所有处理重复3～6次，采用Excel 2016进行数据分析并作图。采用Statistix 9(Tallahassee，FL，USA)进行数据统计和显著性分析，P<0.05为具有显著性差异。

2 实验结果

2.1 松花粉对卵巢早衰大鼠卵巢指数的影响

如图1所示，空白对照组的卵巢指数最高，模型组的卵巢指数最低，约为空白组的52%。松花粉高剂量组、中剂量组、低剂量组的卵巢指数呈梯度下降趋势，且高剂量组的卵巢指数与空白对照组无显著性差异(P>0.05)，低剂量组的卵巢指数与模型对照组无显著性差异(P>0.05)。结果表明，松花粉有增加卵巢指数的作用。

图1 松花粉对大鼠卵巢指数的影响

2.2 松花粉对大鼠卵巢组织病理形态的影响

卵巢病理切片如图2所示。空白对照组的卵巢内可见大量各级卵泡及黄体，未见闭锁卵泡(见图2A)。模型组的卵泡数量明显减少，几乎不见正常发育卵泡，且该组的闭锁卵泡数量最多(见图2B)。阳性对照组各级卵泡数与空白对照组相近，无闭锁卵泡(见图2C)。高剂量松花粉组可见大量成熟卵泡，未见闭锁卵泡(见图2D)。中剂量组可见各级卵泡和闭锁卵泡(见图2E)。与中剂量组相比，低剂量组有少量正常发育的卵泡和更多闭锁卵泡(见图2F)。此外，低剂量组和模型组的卵巢间质有一定程度的纤维化。上述结果表明，松花粉可以增加各级卵泡的数量，减少闭锁卵泡的数量。

图2 各组大鼠的卵巢组织病理形态(100×)

2.3 松花粉对大鼠血清激素的影响

各组大鼠血清中E2、P、LH、FSH、AMH和INHB的水平如图3所示。模型组E2水平与空白组相比降低了17.7 pg/mL，而P、LH和FSH水平分别增加了5.26 ng/mL、21.67 mIU/mL和275.03 ng/mL(P<0.05)。灌胃阳性药物后，激素水平与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。灌胃高、中、低剂量松花粉后，高剂量组6项激素水平与空白对照组均无显著差异(P>0.05)或显著(P<0.05)优于空白组，中剂量组的各项激素水平与模型组相比均有显著(P<0.05)改善，低剂量组与模型组相比，FSH和INHB水平显著(P<0.05)降低了184.27 ng/mL和643.08 pg/mL，AMH显著提高了1.06 ng/mL(P<0.05)，但E2、P和LH的水平与模型组无显著差异(P>0.05)。结果表明，高、中剂量松花粉可以有效调节性激素与促性腺激素水平并提升卵巢的储备功能。

图3 松花粉对大鼠血清E2、P、LH、FSH、AMH和INHB水平的影响

2.4 松花粉对大鼠卵巢细胞凋亡情况的影响

DAPI是一种荧光染料，可以与DNA强力结合，细胞被染色后在荧光显微镜下观察有蓝色荧光，可以表征细胞总数。TUNEL法采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶将荧光素标记到凋亡细胞中断裂的染色体DNA产生的大量粘性3′-OH末端，荧光显微镜下观察凋亡细胞有绿色荧光。如图4中所示，DAPI和TUNEL分别表示细胞总数和凋亡细胞结果，Merge为合并结果，计数后可用于计算颗粒细胞凋亡指数(见表1)。

图4 松花粉对大鼠卵泡颗粒细胞凋亡水平影响

如图4和表1所示，空白对照组中绿色荧光标记的凋亡颗粒细胞很少，对应的凋亡指数约为2.81%。阳性对照组与空白对照组无明显差异(P>0.05)。模型组闭锁卵泡周围可见大量凋亡细胞，凋亡指数最高，约为27.58%。高剂量组颗粒细胞凋亡指数与空白组无显著差异(P>0.05)且显著低于模型组和低剂量组(P<0.05)。因此，可以推断松花粉具有抗颗粒细胞凋亡作用。

表1 颗粒细胞凋亡指数

图5为采用Western blot检测四种凋亡蛋白在卵巢中表达的结果，其中柱状图为四种蛋白条带以β-actin为内参的灰度值结果。模型组与空白组相比，卵巢Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达显著增加，Bcl-2的表达显著降低(P<0.05)。经松花粉灌胃后，Bcl-2和Bax的比例较模型组显著提高且具有量效关系，Caspase-3和Cleaved Caspase-3均有显著下降，高剂量组17 kDa的Cleaved Caspase-3下降最为显著(P<0.05)。结果表明，松花粉可以调控凋亡蛋白的表达且具有一定的量效关系。

图5 松花粉对大鼠卵巢凋亡因子表达的影响

2.5 松花粉对大鼠卵巢抗氧化能力的影响

图6展示了不同剂量松花粉对大鼠卵巢抗氧化能力的影响。模型组的总抗氧化能力(T-AOC)较空白组显著(P<0.05)降低，高剂量组T-AOC较模型组提高了70.30%。卵巢中的其他三种抗氧化酶活力也显示出类似的趋势。模型组的GSH-Px、SOD和CAT的活力较空白组分别下降了46.61%、40.83%和39.70%，灌胃不同剂量的松花粉后，大鼠卵巢抗氧化酶活力均有一定程度的提升，但仅有高剂量组对三种酶活的提升有显著性(P<0.05)。结果表明，松花粉能够提升POF大鼠卵巢的抗氧化能力，且部分具有一定的量效关系。

图6 松花粉对大鼠卵巢T-AOC、GSH-Px、SOD和CAT的影响

2.6 松花粉对大鼠抗炎能力的影响

大鼠血清炎症因子水平如图7所示。模型组的两种炎症因子均呈现较高浓度，比空白对照组显著(P<0.05)提高近3倍。灌胃松花粉后，TNF-α和IL-4均显著下降，且高、中剂量组与空白组无显著差异(P>0.05)。

图7 松花粉对大鼠血清TNF-α和IL-4的影响

3 讨论与结论

松花粉为药食同源原料，其营养成分和功能性质均被广泛研究。有研究表明其具有前列腺保护的功能[10]，且同时具备抗氧化和抗炎的功效[9]，本文通过环磷酰胺诱导大鼠POF模型探讨松花粉对卵巢的保护功能。

患有POF的大鼠多出现与生殖系统相关的血清激素水平的变化，如E2和P水平的明显降低[15]。然而，本文的结果显示模型鼠中P的浓度相对空白组有明显的升高。在POF大鼠中，卵巢囊肿和内分泌失调均可能导致P水平的增加[16]。LH和FSH均由垂体分泌，可调节性激素的合成，促进卵泡成熟和黄体生成[17]。CTX可扰乱与卵巢相关的激素分泌，本研究结果与其他研究一致[18]。卵巢储备是指卵巢皮质中所含原始卵泡的储备，AMH和INHB为主要的判断指标。卵巢组织病理学结果显示模型组卵泡数明显下降，与AMH降低的结果一致。INHB是生殖细胞分泌的一种激素，与生殖能力密切相关，其主要功能是调节FSH的产生[19]。有研究表明，FSH和INHB之间存在负反馈调节[19]，而本文的结果与之相反，原因可能如Carballo等[20]所述，INHB的高水平分泌表明颗粒细胞中存在肿瘤。本文的结果表明，经松花粉灌胃后，大鼠血清激素分泌趋向正常水平，松花粉有调节激素的功能且有量效关系。

CTX诱导POF的主要机制是诱导颗粒细胞凋亡[21]，颗粒细胞的大量凋亡可直接影响卵泡的生长，最终发展为闭锁卵泡[22]，进而导致卵巢内的卵泡数量明显减少甚至耗尽，卵巢储备能力下降。Caspase-3仅出现在闭锁卵泡的颗粒细胞中，而不出现在健康卵泡的颗粒细胞中[23]。Bcl-2相关的促凋亡和抗凋亡蛋白在Caspase蛋白酶上游的细胞内死亡程序的决策步骤中具有重要作用[24]。本研究中松花粉可以调节凋亡蛋白表达，提高Bcl-2和Bax的比例，降低Cleaved Caspase-3的表达，从而抑制颗粒细胞凋亡，促进卵泡的正常发育。

卵巢损伤可由自由基诱导的氧化应激引起，例如活性氧和过氧化氢，氧化应激水平增加最终可以导致DNA损伤和颗粒细胞的凋亡[25]。对于女性生殖系统，抗氧化剂被认为是卵巢生理代谢的关键因素，可以有效降低这些自由基的水平，维护卵巢的健康[26]。然而，它们的确切分子机制和作用尚未完全阐明。CAT、SOD和GSH-Px均在性激素调节中发挥关键作用[27]。本文的结果也表明，高剂量松花粉可以显著提高卵巢的抗氧化酶活性，对卵巢功能具有重要意义。

炎症也是卵巢衰老的可能途径之一，长期的炎症可导致卵巢发生病理变化。肿瘤坏死因子和白细胞介素均是主要的炎症因子，且在卵巢功能减退的大鼠中有较高的表达[28]。有研究认为，卵巢的炎性衰老本质上与氧化应激水平有关，氧化应激与炎症反应互为因果[29]。本研究结果也表明POF大鼠血清的TNF-α和IL-4的浓度升高，有较强的炎症反应，而松花粉可以降低炎症反应的程度。

本文证实了松花粉对CTX诱导的POF大鼠的卵巢具有保护作用，如调节雌激素E2、P和促性腺激素FSH、LH水平、抗颗粒细胞凋亡并调节凋亡因子Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3，提高抗氧化能力并提高抗氧化酶GSH-Px、SOD、CAT活力和降低炎症因子TNF-α和IL-4水平的作用，且松花粉的功能与剂量有一定的相关性。松花粉中含有大量的多糖以及黄酮类化合物，可能与松花粉保护卵巢的功能有关，尚待进一步研究。本研究为以松花粉为原料开发具有卵巢保护功能的健康产品具有一定的理论和实际应用价值。