苯甲酸钠和水杨酸钠逆转革兰阴性菌对多黏菌素的耐药性研究

茅国峰 张小姣

绍兴市人民医院医学检验科，绍兴 312000

多重耐药细菌感染是临床医生面临的一个严重问题。 革兰阴性菌可导致对多种或全部常用抗菌药物耐药， 这促使人们在早期抗菌药物中寻找替代品，如黏菌素（CST）。 CST 类是从产孢子多黏杆菌中分离出的一组阳离子环状多肽抗菌药物，属于多黏菌素家族。 羰基氰氯苯腙（CCCP）是脂溶性质子泵抑制剂，为功能强大的解偶联剂，已广泛用于革兰阴性菌主动外排的研究。 最近，CCCP 诱导多黏菌素逆转对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性已有报道，但这种增强作用的原因尚不清楚。 本文通过寻找能够逆转多黏菌素耐药性的化学物质，包括苯甲酸钠（SB）和水杨酸钠 （SS）， 为临床治疗多重耐药菌感染提供更多依据，现报道如下。

材料与方法

一、菌株来源

2020 年1—12 月收集绍兴市人民医院 163 株非重复革兰阴性杆菌菌株，共筛选到多黏菌素耐药菌9 株，包括鲍曼不动杆菌5 株、变形杆菌2 株、大肠埃希菌1 株、铜绿假单胞菌1 株。 另外，各选1 株对多黏菌素敏感的大肠埃希菌（编号：92407）、铜绿假单胞菌（编号：020417）和鲍曼不动杆菌（编号：91804），作为时间-杀菌试验的对照菌株。 大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853，均购自原卫生部临床检验中心。

二、试剂和仪器

全自动快速微生物质谱检测系统VITEK MS 购自法国生物梅里埃公司；血琼脂平板购自郑州安图公司；微量肉汤稀释法试剂盒购自温州康泰生物生物科技有限公司； 多黏菌素和CCCP 质子泵抑制剂及SB 和 SS 化合物购自 Sigma 公司；PCR 仪购自德国Biometra 公司；Taq 酶及PCR 反应相关试剂购自日本Takara 公司；紫外成像系统购自德国Whatman Biometra 公司。

三、细菌鉴定

菌种鉴定采用法国生物梅里埃公司生产的VITEK MS 全自动快速微生物质谱检测系统。

四、药敏试验

采用2 倍连续稀释法和固定浓度法，分别单独检测多黏菌素、CCCP、SB、SS 的最低抑菌浓度（MIC）及多黏菌素联合 15/30 μmol/L CCCP、15/30 mmol/L SB 和 15/30 mmol/L SS 的 MIC， 初步检测各种潜在增强剂的MIC 值。 根据CLSI M100 2020 版判定标准，大肠埃希菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对多黏菌素的耐药折点均≥4 mg/L。

MIC 测定按照 CLSI 指南和 EUCAST 建议进行。 同时检测多黏菌素单独及联合CCCP、SB 和SS对大肠埃希菌ATCC25922 和铜绿假单胞菌ATCC27853 MIC 的影响。用于测定多黏菌素MIC 的浓度范围为0.063~4 096 mg/L， 所有MIC 测定至少3 次。 一旦确定了MIC， 计算部分抑菌浓度指数（FIC） 用来评估多黏菌素和每种化学物质之间的协同作用。 FIC=MIC/MIC+MIC/MIC。 FIC≤0.5 为协同作用，0.5

五、mcr 耐药基因测定

煮沸法提取细菌DNA 模板。 mcr-1 基因引物序列为 F:5'-GCTCGGTCAGTCCGTTTG-3'；R：5'-GA ATGCGGTGCGGTCTTT-3'）；mcr-2 序列 F:5'-TGTT GCTTGTGCCGATTGGA-3'；R：5'-AGATGGTATTGT TGGTTGCTG-3'）。 反应条件为：95 ℃变性 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s， 共 33 个循环；最后，72 ℃延伸10 min。 PCR 扩增阳性产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果经BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）确定耐药基因分型。

六、质粒转移接合试验

挑选携带mcr 耐药基因大肠埃希菌作为供体菌， 利福平耐药的大肠埃希菌EC600 作为受体菌，体外共培养获取相应接合子。接合子用含3 mg/L 多黏菌素和300 mg/L 利福平的中国蓝平板筛选接合子。 筛选出接合子与受体菌形态相同，PCR 确证接合子是否携带mcr 基因。

七、时间-杀菌试验

挑取纯培养7 株多黏菌素耐药菌落于2 mL 肉汤中，35 ℃18 h 过夜培养。 将过夜培养的菌液调节至0.5 麦氏浊度，再将其稀释100 倍，摇床震荡1.5 h（t+0 h）。 在预先配置好多黏菌素药物浓度（4 mg/L）的肉汤中接种t+0 h 的菌液，使得初始浓度在10CFU/mL左右， 单独及联合30 mmol/L SB、30/15 mmol/L SS或30 μmol/L CCCP 进行时间-杀菌试验。 37 ℃培养24 h，在 7 个时间点（t+0、t+2、t+4、t+8、t+12、t+24 和t+48 h）取10 μL 菌液进行适当稀释涂布平皿，通过连续稀释法测定样本中的活菌落数。 若同一浓度中联合药物组最低菌落计数比单药组最低菌落计数减少≥3 lgCFU/mL 定义为杀菌作用； 减少≥2 lg CFU/mL 定义为协同作用； 减少≤1 lgCFU/mL 定义为无关作用；联合后增加≥2 lgCFU/mL 则定义为拮抗作用。

结 果

一、多黏菌素耐药株MIC

9 株多黏菌素耐药菌株的 MIC 分别为 4、8、4、8、32、1 024、2 048、8 和 4 mg/L， 范围为 4～64 μg/mL（敏感折点为≤2 mg/L）。 从1 株多黏菌素耐药大肠埃希菌中检测到mcr-1 基因， 未成功将耐药质粒转移到受体菌中。

二、质子泵抑制剂和化合物对多黏菌素MIC 的影响

结果表明，30 μmol/L（5 mg/L）CCCP 可降低所有实验菌株的多黏菌素MIC。 除变形杆菌之外，30 μmol/L CCCP、30 mmol/L SB、15 mmol/L SS 和 30 mmol/L SS可将菌株的MIC 降低至临床折点以下（≤2 mg/L）。除1株鲍曼不动杆菌和变形杆菌之外，15 μmol/L CCCP可将其他菌株的MIC 降低至临床折点以下。 使用CCCP 质子泵抑制剂后，2 株天然耐药的变形杆菌菌株多黏菌素的MIC 最低， 但仍然为≥128 mg/L。30 μmol/L CCCP 将2 株鲍曼不动杆菌菌株多黏菌素的MIC 下降幅度最大， 数值只有原来的1/64；2株ATCC 质控菌株的多黏菌素MIC 下降了50%，但两个浓度的SB 和SS 对质控菌株的MIC 没有任何影响。 具体结果见表1。

表1 CCCP、SB 和SS 对各类菌株CST 的最低抑菌浓度的影响（mg/L）

注：CST：多黏菌素；CCCP：羰基氰氯苯腙；SB：苯甲酸钠；SS:水杨酸钠；CCCP15：15 μmol/L CCCP；CCCP30：30 μmol/L CCCP；SB15：15 mmol/L SB；SB30：30 mmol/L SB；SS15：15 mmol/L SS；SS30：30 mmol/L SS；：杀菌试验中对多黏菌素耐药菌株；：杀菌试验中对多黏菌素敏感菌株

菌株名称 CST CCCP CST+CCCP15 CST+CCCP30 SB CST+SB15 CST+SB30 SS CST+SS15 CST+SS30鲍曼不动杆菌72909a 4 272 1 0.5 139 2 1 125 2 1鲍曼不动杆菌82809 8 272 1.0 0.5 139 4 2 125 2 1鲍曼不动杆菌90801 4 272 0.5 0.25 139 2 1 125 1 0.5鲍曼不动杆菌120309 8 272 2 0.125 139 2 1 125 2 0.5鲍曼不动杆菌120310 32 272 4 0.5 139 4 2 125 2 1变形杆菌11213a 1 024 136 1 024 128 278 1 024 1 024 250 1 024 1 024变形杆菌11215 2 048 136 2 048 128 278 2 048 2 048 250 2 048 2 048大肠埃希菌91610a 8 68 2 0.25 139 4 1 250 2 1铜绿假单胞菌011917a 4 136 2 0.5 139 2 1 125 2 1大肠埃希菌ATCC25922 0.5 68 0.5 0.25 139 0.5 0.5 62.5 0.5 0.5铜绿假单胞菌ATCC27853 0.5 136 0.5 0.25 139 0.5 0.5 62.5 0.5 0.5大肠埃希菌b 1 136 0.5 0.5 139 0.5 0.25 62.5 1 0.5铜绿假单胞菌b 1 136 1 0.5 139 1 0.5 62.5 1 0.5鲍曼不动杆菌b 1 136 1 0.5 139 1 1 62.5 1 0.5

三、联合药敏试验结果

FIC 结果显示， 多黏菌素与 CCCP 或 SB 或 SS联合后，对除变形杆菌之外的7 株细菌均有协同或相加作用。 其中，30 μmol/L CCCP 对包括变形杆菌在内的所有菌株均有协同作用，30 mmol/L SB 和30 mmol/L SS 对除变形杆菌之外的所有菌株均有协同作用，多黏菌素联合15 μmol/L CCCP、15 mmol/LSB、30 mmol/L SB、15 mmol/L SS 或 30 mmol/L SS 对变形杆菌的联合药敏结果均无作用。本次联合药敏实验中，未发现产生拮抗作用的菌株，具体结果见表2。

表2 CST 联合 CCCP、SB、SS 的药敏试验结果

注：CST：多黏菌素；CCCP：羰基氰氯苯腙；SB：苯甲酸钠；SS:水杨酸钠；FIC：部分抑菌浓度指数；DI：药物相互作用；CCCP10：10 μmol/L CCCP；CCCP25：25 μmol/L CCCP；SB14：14 mmol/L SB；SB28：28 mmol/L SB；SS14：14 mmol/L SS；SS28：28 mmol/L SS

菌株名称 CST+CCCP10 CST+CCCP25 CST+SB14 CST+SB28 CST+SS14 CST+SS28 FIC DI FIC DI FIC DI FIC DI FIC DI FIC DI鲍曼不动杆菌72909 0.287 协同 0.217 协同 0.601 相加 0.451 协同 0.612 相加 0.474 协同鲍曼不动杆菌82809 0.162 协同 0.154 协同 0.601 相加 0.451 协同 0.362 协同 0.349 协同鲍曼不动杆菌90801 0.162 协同 0.154 协同 0.601 相加 0.451 协同 0.362 协同 0.349 协同鲍曼不动杆菌120309 0.287 协同 0.108 协同 0.351 协同 0.326 协同 0.362 协同 0.287 协同鲍曼不动杆菌120310 0.162 协同 0.108 协同 0.226 协同 0.264 协同 0.175 协同 0.287 协同变形杆菌11213 1.278 无关 0.309 协同 1.050 无关 1.101 无关 1.056 无关 1.112 无关变形杆菌11215 1.278 无关 0.247 协同 1.050 无关 1.101 无关 1.056 无关 1.112 无关大肠埃希菌91610 0.397 协同 0.399 协同 0.601 相加 0.326 协同 0.181 协同 0.237 协同铜绿假单胞菌011917 0.575 相加 0.309 协同 0.601 相加 0.451 协同 0.612 相加 0.474 协同

四、多黏菌素体外杀菌试验结果

多黏菌素联合30 μmol/L CCCP 对除变形杆菌之外的所有菌株均有较强的杀菌作用， 对变形杆菌具有较好的协同作用。 在t+4 h， 多黏菌素联合30 μmol/L CCCP 或 30 mmol/L SB 或 15 mmol/L SS或30 mmol/L SS 对大肠埃希菌的最低菌落计数均减少≥3lg CFU/mL；在t+8 h，多黏菌素联合30 μmol/L CCCP 或 28 mmol/L SB 或 14 mmol/L SS 或28 mmol/L SS 对铜绿假单胞菌的最低菌落计数均减少≥3lg CFU/mL； 在 t+12 h， 多黏菌素联合 30 μmol/L CCCP 或 28 mmol/L SB 或 15 mmol/L SS 或30 mmol/L SS 对鲍曼不动杆菌的最低菌落计数均减少≥3lg CFU/mL；多黏菌素联合 30 μmol/L CCCP 在t+12 h 之后对变形杆菌具有协同作用。 所有多黏菌素耐药菌株在48 h 时杀菌效果达到了最佳状态。具体结果见图1。

图1 多黏菌素单独及联合CCCP、SB 和SS 时的体外杀菌曲线

讨 论

多黏菌素被认为是目前治疗碳青霉烯类耐药革兰阴性菌的最后一道防线，因此耐药多黏菌素细菌的广泛传播引起了临床工作者的警惕。 质粒介导的可移动多黏菌素耐药基因mcr 可在动物、食品、农场、人类和环境中分离到的不同细菌中检出。 本研究从多黏菌素耐药大肠埃希菌（MIC=8 mg/L）中检测到mcr-1 耐药基因， 推测该基因在菌株对多黏菌素耐药机制中发挥了重要作用，但结合试验未取得成功，可能与菌株耐药质粒转移到受体菌需要付出适应性代价有关。

CCCP 是最典型的质子泵抑制剂， 为一种抑制质子转运的解耦联剂，其作用是破坏外排系统的主动外排作用，能显著降低耐药菌的MIC。 有研究表明，CCCP 可逆转大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌属等对多黏菌素的耐药性。 本研究对9 株多黏菌素耐药革兰阴性菌菌株进行了检测， 结果显示，CCCP、SB 或 SS 联合多黏菌素后，均可不同程度地降低多黏菌素的MIC 值，SB 和SS引起的多黏菌素耐药性逆转与CCCP 相似， 除变形杆菌之外，其余大部分菌株对多黏菌素的MIC 均下降至折点以下。 SS 和SB 对多黏菌素MIC 的下降原因不能完全用外排泵来解释，其作用机制可能与其生理pH 下的负电荷及脂溶性有关。 本研究中，高浓度 CCCP（30 μmol/L）对多黏菌素 MIC 逆转的幅度最大，但低浓度 CCCP（15 μmol/L）对 2 株 ATCC质控菌株的MIC 没有任何变化，同Malla 等研究类似，可见高浓度的CCCP、SB 和SS 对增强多黏菌素的杀菌能力更有效，浓度依赖性的抑菌剂可更有效地增强多黏菌素的杀菌作用。

本次联合药敏结果显示， 多黏菌素和CCCP 或SB 或SS 联合后， 对除变形杆菌之外的细菌均有协同或相加作用， 高浓度的CCCP 对包括变形杆菌在内的所有菌株均有协同作用，且所有联合药敏实验结果中均未发现产生拮抗作用的菌株，杀菌试验结果与联合药敏试验结果基本一致。 以上结果表明，SB 和SS 均是多黏菌素良好的抗菌佐剂， 它们对获得性耐药菌株具有类似CCCP 的杀菌效果。 但SB、SS 与 CCCP 不同， CCCP 是一种氧化磷酸化抑制剂，具有较大的毒性，可导致细胞的逐渐损害以及生命体的死亡，而SB 和SS 毒性较小且已被批准用做人类食用防腐剂，并能治疗和预防很多疾病。根据本研究初步结果，SB 和SS 可部分或完全逆转多黏菌素的耐药性，这为临床在治疗多黏菌素耐药革兰阴性菌引起的感染提供了新的思路。

综上，SB 和SS 可部分或完全逆转多黏菌素的耐药性，是包括多黏菌素等抗菌药物治疗的良好促进剂。 但因本研究中菌株数量有限，且不同革兰阴性菌对多黏菌素耐药机制存在差异，故SB 和SS 逆转不同革兰阴性菌对多黏菌素耐药性的机制有待进一步研究。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

茅国峰：设计研究思路及方案、统计分析、撰写论文；张小姣：材料收集、实验操作