SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的表观遗传调控

林永 李丽 刘琦 闫东升

作者单位：温州医科大学附属眼视光医院 省部共建眼视光学和视觉科学国家重点实验室，温州 325027

葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一种成人最常见的眼内恶性肿瘤，多发于40～60 岁，多见于眼的脉络膜后极部，起源于眼内葡萄膜黑色素细胞。目前主要治疗手段有激光、局部放疗和局部切除术联合药物治疗，严重时需行眼球摘除术。50% UM患者会发生肝脏转移，转移后致死率极高，目前其发病机制尚不清楚。

近年来越来越多的研究发现表观遗传调控参与葡萄膜黑色素瘤的发生发展，包括DNA甲基化、RNA甲基化、非编码RNA和组蛋白乙酰化修饰等。沉默信息调节蛋白1（Silent information regulator protein 1，SIRT1）是第III类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶，通过去乙酰化组蛋白或非组蛋白底物调节细胞的不同生物学行为，包括细胞周期、迁移、凋亡、代谢和自噬等方面。近年来研究发现SIRT1在肿瘤的发生发展中发挥着非常复杂的作用，SIRT1能促进一些肿瘤细胞的增殖、迁移，从而促进肿瘤的发生发展，如乳腺癌、结直肠癌、肝癌等。除此之外，SIRT1高表达会导致卵巢癌、肺癌等肿瘤对化疗产生一定的抵抗性，从而影响治疗效果，故SIRT1被称为促癌因子。但也有一些研究表明SIRT1可以抑制肿瘤的发生发展，如胃癌、口腔鳞状上皮细胞癌等，但其在葡萄膜黑色素瘤中的调控机制尚未明了。

本研究通过检测SIRT1在正常葡萄膜黑色素细胞和葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达情况，探讨抑制SIRT1活性或表达后对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖及相关蛋白和信号通路的影响，为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供新的策略和思路。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

葡萄膜黑色素瘤细胞M23 由美国纽约医学院胡诞宁教授惠赠；人眼葡萄膜黑色素瘤细胞SP6.5、人眼葡萄膜黑色素细胞DM78由加拿大魁北克免疫学研究中心提供；人眼葡萄膜黑色素细胞UM95、UM96由温州医科大学附属眼视光医院实验中心提供。

1.2 实验动物

清洁级6周雌性裸鼠12只，由温州医科大学实验动物中心提供，实验动物的喂养和使用遵循温州医科大学实验动物中心的规定。

1.3 实验试剂和仪器

胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、青霉素/链霉素和Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基均购于美国GIBICO公司。0.05%胰酶、小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）转染试剂均购于美国Invitrogen公司。MTS细胞增殖分析试剂购于美国Promega公司，抗体E2启动子结合因子1（Adenovirus E2 factor-1，E2F1）、磷酸化视网膜细胞瘤基因（Phospho-Retinoblastoma gene，p-RB）、周期素D2（CYCLIND2）、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，P21）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Phospho-Serine Threonine kinase，p-AKT）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine Threonine kinase，AKT），β-肌动蛋白（β-ACTIN，）均购于美国cell signal technology公司。硝酸纤维素膜购于德国GE Healthcare公司。实时定量PCR仪购于美国ABI公司，流式细胞仪购于美国BD公司，SpectraMax M5 酶标仪购于美国Molecular Devices 公司，IVIS®Lumina III 活体成像仪购于美国Lumina公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 细胞培养于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM的培养液中，培养条件为37 ℃、5% CO,用0.05%胰酶消化并以1:4～1:8传代，培养至对数生长期后用于实验。

1.4.2 药物处理 EX527用DMSO溶解，用培养基稀释成1、2.5、5、10、25 μmol/L(μM)作用于M23和SP6.5作为实验组，以含有溶剂DMSO的培养基处理作为阴性对照。根据MTS实验结果后续实验采用5 μM。

1.4.3 siRNA转染 将M23、SP6.5接种在12孔板中，待细胞长到30%～40%，将2 μl lipo RNAiMAX和6 μL siRNA 稀释在250 μl OPTI-MEM培养基中，室温静置15 min后加入细胞中。siRNA序列如下：siNC：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3’；siSIRT1：5’-GAA GTT GAC CTC CTC ATT GT-3’。

1.4.4 MTS法检测细胞增殖 收集处于对数生长期的M23和SP6.5细胞，按照每孔5×103细胞数量接种于96孔培养板，每孔100 μl，每组设置6个复孔，细胞培养24 h后加入不同浓度的EX527或者进行siRNA转染，作用48 h后每孔加入15 μl的MTS和85 μl F12培养基，置于37 ℃培养箱避光继续孵育2 h，用酶标仪在490 nm波长下读取各孔的光密度值（Optical density，OD）。以上实验重复3次。

1.4.5 流式细胞术分析细胞周期 使用Cycle test plus试剂盒（Becton Dickinson）检测，细胞接种在6 孔板中，EX527处理或siRNA转染48 h后，用0.05%胰酶消化细胞，血清中和之后进行碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色，用细胞流式仪分析细胞周期分布。以上实验重复3次。

1.4.6 细胞克隆形成实验 将M23、SP6.5细胞接种于6孔板，每孔接种3000个细胞，培养1周后，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养基，用4%多聚甲醛进行固定，1% 结晶紫染色液染色10 min。以上实验重复3次。

1.4.7 眼内成瘤实验 6周龄雌性裸鼠分成siSIRT1和NC两组，每组6只。SP6.5分别转染SIRT1 siRNA或者NC，24 h后收集细胞，用0.9%氯化钠溶液稀释成浓度为1×105 个细胞/μl，裸鼠右眼前房注射SIRT1 siRNA转染组或者NC siRNA 转染组SP6.5细胞2 μl。每周补注射SIRT1或者NC siRNA，3周后使用活体成像仪观察眼内肿瘤形成情况，进行活体生物荧光成像分析。

1.4.8 Western blot法 蛋白裂解液RIPA（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞后，离心取上清，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，变性，取20 μg蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，300 mA恒流转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭液封闭，一抗孵育过夜，荧光二抗室温孵育1 h，曝光获得目的蛋白条带。用Image J软件计算蛋白条带灰度值。抗体名称及稀释浓度如下：E2F1（1:1000）、p-RB（1:1000）、CYCLIN D2（1:1000）、P21（1:1000）、p-AKT（1:1000）、AKT（1:1000）、SIRT1（1：1000），β-ACTIN（1:1000）作为内参。

1.4.9 RNA收集和定量PCR 用Trizol法提取葡萄膜黑色素瘤细胞（M23和SP6.5）和正常人葡萄膜黑色素细胞（DM78、UM95和UM96）中RNA，测量浓度后，取RNA 1 μg，在20 μl 逆转录体系中合成cDNA，以1 μl cDNA 为模板加入靶基因上下游引物，在20 μl 体系中进行PCR 扩增。用ACTB作为内参，用2法定量分析基因表达水平。引物：SIRT1-forward:5’-TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3’;SIRT1-reverse:5’-ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3’;ACTB-forward:5’-GAT CAT TGC TCC TCC TGA GC-3’;ACTB-reverse:5’-ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC-3’.

1.5 统计学方法

实验研究。采用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据符合正态分布，且方差齐，以表示。组间比较采用独立样本

t

检验。以

P

＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT1在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达

定量PCR检测结果显示M23 和SP6.5 细胞中SIRT1 mRNA表达显著增高（

t

=17.08，

P

＜0.001；

t

=13.24，

P

＜0.001），Western blot检测发现M23 和SP6.5 细胞中SIRT1 蛋白水平也显著增高（

t

=6.26，

P

=0.008），见图1。

图1.正常葡萄膜黑色素细胞和葡萄膜黑色素瘤细胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表达情况A：定量PCR检测SIRT1 mRNA在葡萄膜黑色素瘤细胞（M23、SP6.5）和葡萄膜黑色素细胞（DM78、UM95、UM96）中的表达，b P＜0.01；B：Western blot检测葡萄膜黑色素瘤细胞（M23、SP6.5）和葡萄膜黑色素细胞（DM78、UM95、UM96）中SIRT1蛋白表达情况，β-ACTIN为内参Figure 1.The expression levels of SIRT1 in uveal melanocytes and uveal melanoma cells.A:Quantitative RT-PCR analysis of SIRT1 mRNA in the three melanocytes (DM78,UM95 and UM96) and the two UM cells (M23 and SP6.5),b P＜0.01.B:Western blot detected the protein expression of SIRT1 in the UM cells (M23,SP6.5) and the control melanocytes (DM78,UM95 and UM96).β-ACTIN was used as an endogenous control.

2.2 SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞活性的影响

将SIRT1 抑制剂EX527 浓度设置成1、2.5、5、10、25 μmol/L，DMSO溶剂作为对照，作用于M23、SP6.5 48 h后，与DMSO组相比，细胞在5 μmol/L时活力开始明显受到抑制，差异有统计学意义（

t

=9.15,

P

＜0.001;

t

=4.56,

P

=0.002），并且呈现一定的浓度依赖性，见图2A。SIRT1 siRNA转染M23和SP6.5 48 h后检测细胞活性，与NC转染组相比，siSIRT1转染组的细胞活性受到明显的抑制，差异有统计学意义（

t

=5.94,

P

＜0.001;

t

=10.73,

P

＜0.001），见图2B。

图2.SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞活性的影响A：不同浓度梯度EX527作用于M23和SP6.5 48 h后，对细胞活性的影响；B：SIRT1 siRNA转染48 h后对M23和SP6.5细胞活性的影响。M23和SP6.5：人葡萄膜黑色素瘤细胞;NC，无义siRNA转染；siSIRT1，SIRT1 siRNA转染Figure 2.The effect of SIRT1 on the viability of uveal melanoma cells.A:The cytotoxic effect of concentration gradients of EX527 on UM cells for 48 h.B:The effect of SIRT1 siRNA transfection on UM cell viability.M23 and SP6.5:Human uveal melanoma cell lines;NC:negative control siRNA transfection;siSIRT1:SIRT1 siRNA transfection group.

2.3 SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响

为了进一步探讨SIRT1 对葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响，用5 μmol/L EX527 和SIRT1 siRNA处理M23和SP6.5 48 h，与DMSO处理组相比，EX527 处理组中处于G1 期细胞数量明显增多[（56.92±1.15）%

vs.

64.09±0.80）%；（50.7±1.23）%

vs.

（76.79±3.21）%]差异有统计学差异（

t

=5.10，

P

=0.047;

t

=7.57,

P

=0.002），见图3A—B。和NC组相比，SIRT1 siRNA转染组中处于G1 期细胞数量也显著增加[（52.25±1.37）%

vs.

（66.61±1.77）%；（52.25±1.37）%

vs.

（67.72±2.10）%]差异有统计学意义（

t

=6.41,

P

=0.003,

t

=6.10,

P

=0.004），见图3C—D。以上结果提示下调SIRT1活性或表达导致葡萄膜黑色素瘤细胞G1期阻滞。

图3.SIRT1对人葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响A：流式细胞术分析EX527处理M23和SP6.5细胞周期分布；B：M23、SP6.5细胞处于G1、G2、S期统计图；C：流式细胞术分析SIRT1和NC siRNA转染后M23和SP6.5细胞周期分布；D：M23、SP6.5细胞处于G1、G2、S期统计图。aP＜0.05;bP＜0.01。M23和SP6.5：人葡萄膜黑色素瘤细胞Figure 3.The effect of SIRT1 on the cycle distribution of uveal melanoma cells.A:Effect of EX527 on cell cycle distribution in uveal melanoma cells (M23,SP6.5) analyzed by flow cytometry.B:Statistical histograms of cell distribution in stages G1,G2,and S of uveal melanoma cells.C:Effect of SIRT1 siRNA on cell cycle distribution in uveal melanoma cells (M23,SP6.5) analyzed by flow cytometry.D:Statistical histograms of cell distribution in stages G1,G2,and S.aP＜0.05;bP＜0.01.M23 and SP6.5:Human uveal melanoma cells lines.

2.4 SIRT1 对葡萄膜黑色素瘤细胞克隆形成能力的影响

细胞克隆形成实验是检测肿瘤细胞增殖能力的重要手段。结果显示，用EX527和SIRT1 siRNA处理M23和SP6.5后，与DMSO组相比，EX527处理组细胞克隆形成斑明显减小，数目分别减少了（30.10±2.06）%和（25.77±3.54）%，差异有统计学意义（

t

=5.04,

P

=0.001;

t

=5.93,

P

＜0.001）；与NC组比较，siSIRT1 转染组克隆形成斑也明显减小，数目也显著减少，差异有统计学意义（

t

=11.44,

P

＜0.001;

t

=8.24,

P

＜0.001），见图4。以上结果提示抑制SIRT1的活性或表达可以明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的克隆形成能力。

图4.SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞克隆形成能力的影响与阴性对照组相比，EX527处理组和siSIRT1转染组抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的克隆形成。DMSO：DMSO处理对照组；EX527：5 μmol/L EX527处理组；NC：阴性转染组；siSIRT1：SIRT1 siRNA转染组；M23和SP6.5：人葡萄膜黑色素瘤细胞Figure 4.The effect of SIRT1 on the colony formation ability of uveal melanoma cells.Compared with the negative control group,the EX527 and SIRT1 siRNA transfected groups and markedly suppressed colony formation of uveal melanoma cells.DMSO:Cells were treated with DMSO;EX527:Cells were treated with 5 μmol/L EX527;NC:Negative control siRNA transfection;siSIRT1:SIRT1 siRNA transfected group;M23 and SP6.5:Human uveal melanoma cell lines.

2.5 SIRT1 对眼内葡萄膜黑色素瘤细胞成瘤能力的影响

鉴于SIRT1 活性或表达的下调可以明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖，本研究进一步探讨SIRT1对体内葡萄膜黑色素瘤形成的影响，将转染了SIRT1或者NC siRNA的SP6.5细胞注射到裸鼠的前房，3 周后观察体内成瘤情况。结果显示，转染SIRT1 siRNA组的荧光强度显著低于NC 组，差异有统计学意义（

t

=5.50,

P

＜0.001），见图5。以上数据提示SIRT1下调可以抑制葡萄膜黑色素瘤细胞在裸鼠眼内生长。

图5.下调SIRT1表达对葡萄膜黑色素瘤细胞眼内成瘤能力的影响与NC转染组相比，SIRT1 siRNA组可明显抑制人葡萄膜黑色素瘤细胞眼内肿瘤形成大小。NC：无义小干扰RNA转染组。bP＜0.01Figure 5.The effect of SIRT1 knockdown on the tumor-genesis ability of uveal melanoma cells in vivo.SIRT1 siRNA transfection suppressed the tumor genesis of uveal melanoma cells compared to the NC-transfected group.NC:Negative control siRNA transfection.bP＜0.01

2.6 SIRT1 对葡萄膜黑色素瘤细胞中周期相关蛋白和p-AKT的影响

如图6 所示，EX527 处理或者siSIRT1 转染48 h后收集蛋白，Western blot结果显示，与DMSO处理组相比，EX527 处理组中P21（

t

=4.63,

P

=0.010;

t

=7.90,

P

=0.001）表达升高，E2F1（

t

=12.10,

P

=0.003;

t

=5.96,

P

=0.004）、CYCLIND2（

t

=36.28,

P

＜0.001;

t

=16.58,

P

＜0.001）、p-RB（

t

=17.55,

P

＜0.001;

t

=21.34,

P

＜0.001）表达都有不同程度降低，p-AKT在EX527 作用下表达也下调。与NC转染组相比，siSIRT1 转染组中，P21（

t

=5.88,

P

=0.004;

t

=10.51,

P

＜0.001）表达升高，E2F1（

t

=4.60,

P

=0.01;

t

=4.89,

P

=0.008）、CYCLIND2（

t

=5.13,

P

=0.007;

t

=5.63,

P

=0.005）、p-RB（

t

=4.45,

P

=0.011;

t

=6.53,

P

=0.003）、p-AKT（

t

=9.61,

P

＜0.001;

t

=6.44,

P

=0.003）表达也均下调。

图6.SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞周期相关蛋白和p-AKT的影响A：SIRT1抑制剂EX527对葡萄膜黑色素瘤细胞周期相关蛋白和p-AKT的影响；B：siSIRT1转染对葡萄膜黑色素瘤细胞周期相关蛋白和p-AKT的影响。p-AKT，磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶；AKT，丝氨酸/苏氨酸激酶；P21，细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A；CYCLIND2，周期素D2；E2F1，腺病毒E2启动子结合因子1；p-RB，磷酸化视网膜母细胞瘤基因；β-ACTIN为内参Figure 6.The effect of SIRT1 on the expression of cell cycle-associated proteins and p-AKT in uveal melanoma cells.A:The effect of EX527 on the expression of cell cycle-associated proteins and p-AKT in uveal melanoma cells.B:The effect of SIRT1 siRNA transfection on the expression of cell cycle-associated proteins and p-AKT in uveal melanoma cells.p-AKT,Phospho-Serine Threonine kinase;AKT,Serine Threonine kinase;P21,cycle-dependent kinase inhibitor 1A;E2F1,adenovirus E2 factor-1;p-RB,phospho-retinoblastoma gene;β-ACTIN was used as the endogenous control.

3 讨论

越来越多的研究发现表观遗传调控在葡萄膜黑色素瘤发生发展中都发挥着重要的作用，如组蛋白H3K27Me3甲基化酶EZH2抑制剂DZNeP能明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖。RNA甲基化酶METTL3 可以通过C-MET调控葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖和迁移。本研究发现与正常人葡萄膜黑色素细胞相比，组蛋白去乙酰化酶SIRT1在葡萄膜黑色素瘤细胞中mRNA和蛋白表达水平都升高，提示着SIRT1在UM发生发展中起着重要的作用。与本研究相似，近年有研究也发现SIRT1在多种肿瘤中表达都升高，如在结肠癌细胞中SIRT1表达上调，增加了结直肠癌细胞的迁移和侵袭；在肝细胞癌中SIRT1 过表达与肿瘤大小、肿瘤数目、预后不良相关。故SIRT1也越来越受到研究人员的重视，有望成为治疗肿瘤的新靶标。

本研究采用SIRT1抑制剂EX527和小干扰RNA两种方法分别抑制SIRT1的活性和蛋白表达，结果发现下调SIRT1 活性或表达导致细胞周期G1 期阻滞，从而抑制细胞增殖。研究发现SIRT1 抑制剂EX527也可以抑制其他肿瘤的增殖，如EX527能抑制神经胶质瘤细胞和的增殖。另外，EX527也能抑制肿瘤细胞的迁移。上述结果提示SIRT1抑制剂EX527 有望成为临床治疗葡萄膜黑色素瘤的潜在药物。

细胞周期对细胞增殖发挥着重要的作用，受到关键细胞周期蛋白的调控，如周期素依赖性蛋白激酶（Cyclindependent kinases，CDK）、周期素（Cyclin）、P21以及p-Rb等。P21蛋白是一种周期素依赖蛋白激酶的抑制因子，能和Cdk4-CyclinD2复合物结合，抑制Rb的磷酸化，当Rb处于低磷酸化时，其扣留着大量的转录因子E2F1，使它们不能发挥作用，从而阻断细胞周期的行进。本研究Western blot检测结果显示，下调SIRT1 活性或表达可以明显上调P21 表达，下调p-Rb、E2F1和CyclinD2 的表达。可见，SIRT1 通过调控P21-CyclinD2-p-RB/E2F1一系列周期蛋白调控葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖。AKT，也称蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB）是PI3K-AKT细胞内信号转导途径中的重要蛋白，响应细胞外信号，促进代谢、增殖、细胞存活和血管生成，磷酸化AKT异常表达会导致肿瘤的发生。研究发现在乳腺癌、肺癌等肿瘤中SIRT1通过调控p-AKT促进其发生发展。本研究中，下调SIRT1活性或表达明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞中p-AKT表达，从而影响细胞的增殖，尽管SIRT1对肿瘤细胞的增殖可能存在其他调控机制，但其对细胞增殖的抑制作用提示了SIRT1是葡萄膜黑色素瘤临床治疗的新靶标。

综合上述分析，下调SIRT1 的活性或蛋白表达抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的活性，并抑制AKT信号通路。本研究揭示了SIRT1对葡萄膜黑色素瘤增殖有重要的调控作用，为临床葡萄膜黑色素瘤的治疗提供了新思维和新策略。

利益冲突申明

本研究无任何利益冲突

作者贡献声明

林永：参与选题、设计，实验研究，收集数据，资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。李丽、刘琦：参与实验研究，收集数据，资料的分析和解释。闫东升：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修