茚三酮比色法测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量

2022-07-06侯旭南杨妍林川刘犇徐青霞

经济技术协作信息 2022年20期

◎侯旭南杨妍林川刘犇徐青霞

本文利用茚三酮反应产生特征颜色，改变溶液的吸光度，采用可见光分光光度法对药膳鸡汤及其冻干粉中的氨基酸含量进行分析，建立快速评价冻干药膳鸡汤的新方法。测定结果表明，茚三酮法测定冻干粉中氨基酸含量具有良好的线性（R2=0.9996），准确性（回收率 98.51%～101.61%）。12 种冻干药膳鸡汤中氨基酸含量介于540～2510μg/ml 之间；冻干药膳鸡汤中氨基酸含量随其煎煮时长和食盐的增加而提高。

中医药膳学是在中医理论指导下研究食药两用食材的理论及应用的学科，是中医学的一个重要组成部分，是在长期实践中积累逐渐形成的经验学科。由于食疗药膳的传统烹饪方式商品化程度过低，无法满足快节奏时代的需要，导致其在现代社会的推广受限。随着真空冷冻干燥技术成本的降低，冻干药膳产品有望实现产业化。药膳鸡汤作为受众人群最为广泛的食疗药膳，是以药食两用的中药与鸡肉及天然调料熬煮而成。《内经》记载，药膳鸡汤有益气温中、填精补虚、健脾胃、益五脏、强筋壮骨的功效，适用于营养不良、畏寒肢冷、易疲劳、月经不调等症状。鸡肉营养丰富，蛋白质含量高，含有多种人体必须氨基酸。以鸡肉为基础开发药膳鸡汤，并以现代冻干技术制备方便快捷的药膳鸡汤冻干粉可以实现营养、功能和便捷性的高度融合。药膳冻干鸡汤的开发有利于药膳的推广和工业化生产，是药膳鸡汤未来研究和发展的趋势。

谷氨酸是酸性氨基酸，分子内含两个羧基增加了其在极性溶剂中的溶解能力，因此微溶于水。谷氨酸几乎不溶于乙醚等非极性溶剂，也不溶于甲醇和乙醇。谷氨酸作为食品行业常见的呈鲜物质之一，对鸡汤鲜味具有重要的贡献。L-谷氨酸可作为药品参与大脑的蛋白质代谢，促进氧化，是人脑中重要的兴奋性神经递质。

本实验以谷氨酸为研究目标，利用谷氨酸与茚三酮反应生成特征颜色的原理，采用可见光分光光度法测定570nm波长下溶液的吸光度，根据朗伯-比尔定律计算其中的游离氨基酸的含量。本方法简便实用，不需要复杂仪器。以几种不同工艺制备的冻干药膳鸡汤为研究对象，对冻干粉中氨基酸检测条件进行探究，对氨基酸含量进行测定，以此建立起简便、高效测定冻干药膳鸡汤中氨基酸含量的方法并筛选出冻干药膳鸡汤的最佳工艺，可为中医食疗药膳工业化生产提供思路。

一、实验部分

1.试验仪器。

真空冷冻干燥机，LGJ-10，北京松源华兴科技发展有限公司；pH 计，PHS25，上海仪电科学仪器股份有限公司；紫外及可见分光光度计，721，江苏江东精密仪器有限公司；电子天平，JT1003B，鹤壁市瑞普仪器仪表有限公司。

2.试验试剂。

谷氨酸标准品，中国食品药品检定研究院；苯骈戊三酮（茚三酮），AR，天津市奥普升化工有限公司；柠檬酸，AR，天津市凯通化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，AR，天津市致远化学试剂有限公司；氯化亚锡；分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司。

3.溶液的制备。

（1）谷氨酸标准溶液的制备。

精密称取200.00 mg 干燥的谷氨酸于烧杯中，加入100 mL 水溶解，转移至1L 容量瓶，定容至刻度，即得谷氨酸标准液200 μg/mL，作为母液保存备用。

（2）2%茚三酮溶液的配制备。

精密称取1.00g 茚三酮，加入35mL 乙醇，低温加热溶解。加入40mg 氯化亚锡，搅拌过滤，加乙醇定容至50mL，冷却后放置于0℃~5℃冰箱保存备用。

（3）缓冲溶液的制备。

0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：将28.40g 磷酸氢二钠用蒸馏水定容至1L 备用。

0.1mol/L 柠檬酸溶液：21.01g 柠檬酸加蒸馏水溶解，定容至 1L 备用，分别配制 pH 为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的缓冲溶液。

4.样品的前处理。

（1）样品的来源。

实验所用鸡骨架采购自超市，来源于黑龙江正大实业有限公司；干人参购于药店，枸杞、红枣、料酒、复合香辛料、葱、姜购于本地生鲜超市。

（2）样品前处理。

药膳鸡汤的制备称取相同质量（每份100 g）新鲜鸡骨架，剔除鸡油脂及内脏，清洗干净，切成边长约7 cm 的肉块，用沸水焯后各加入2.5 倍水（质量比）、1%的料酒、0.025%复合香辛料、0.7%葱和姜，0.9%红枣、0.7%枸杞、0.3%干人参，分别加入1.0%、1.5%、2.0%的食盐，置于隔水炖锅中，在煲汤模式下分别加热煮制 0.5、1.0、1.5、2.0h。

（3）样品的制备。

取相同质量煮制完成的药膳鸡汤各50g，静置冷却，撇去油脂，用200 目绢布过滤，收集滤液置于0-4℃冰箱保鲜24h，再次分离上层黏稠油脂，置于-5℃以下温度冷冻至完全固化，随后在-45℃的环境中下真空冷冻干燥24h，得冻干药膳鸡汤样品12 份。

（4）操作注意点。

①100g 鸡骨架冷水浸泡清洗，连同骨架上所附带的肉质，于沸水中预处理1 min，除去表层浮沫，捞出冷却沥干备用。

②原料冷水处理先用旺火，后用慢火。其目的主要为先使原料中的水温得到迅速提高，再次改为慢火，使材料中的营养成分溶解。如果持续使用旺火，材料内部的蛋白质就可能会凝固，无法继续溶解溢出。

研究溶液pH、显色剂用量、加热及冷却时间对谷氨酸溶液吸光度的影响，选出最佳检测条件并测定冻干药膳鸡汤样品的氨基酸含量。

二、结果

1.反应条件的选择。

氨基酸溶液与茚三酮共热生成茚二酮胺，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可根据茚二酮胺在570 nm 处吸光度值测定氨基酸的含量。

（1）溶液 pH 的影响。

取6 支 25 mL的比色管，分别加1mL的 pH 为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的缓冲盐溶液与 1.0 mL茚三酮溶液、2.0 mL谷氨酸标准溶液、2.0mL水，在100 ℃条件下水浴加热15min，冷却10min，加水定容至25mL。分别测其570 nm 处吸光度值。结果如图1 所示：谷氨酸溶液在pH 8.0 处有最大吸光度。

图1 pH 对谷氨酸溶液吸光度的影响

（2）显色剂用量的影响。

陈武在致辞中表示，广西壮族自治区成立60年来，全区各族人民共同团结奋斗、共同繁荣发展，创造了令人瞩目的成就。第十二届园博会的举办是广西贯彻习近平生态文明思想、推进生态文明建设的重要实践，是打造广西“山清水秀生态美”金字招牌的重要机遇。广西各族人民将全力当好东道主，努力打造一届精彩圆满、特色浓郁的园林盛会，诚邀各界朋友到广西走走看看，亲身感受八桂壮乡的独特魅力。

取 7 支在 25 mL的比色管，分别加入 0.7、1.0、1.2、1.5、1.7、2.0、2.2 mL的2.0%茚三酮溶液与3.0 mL 谷氨酸标准溶液、1.0 mL缓冲盐溶液然后分别补入 2.3、2.0、1.8、1.5、1.3、1.0、0.8 mL水，在100 ℃条件下水浴加热15min，冷却10min，加水定容至25mL。分别测其570 nm 处吸光度值。结果如图2 所示：初始阶段显色剂用量与吸光度成剂量增长关系，吸光度数值先增大后趋于平衡，在2.0mL处接近最大值；根据实验结果确定取2.0 mL为茚三酮用量。

图2 显色剂用量对谷氨酸溶液吸光度的影响

（3）加热时间的影响。

取7 支25 mL的比色管，分别加1mL的pH 为8 的缓冲盐溶液与1.0 mL 茚三酮溶液、2.0 mL谷氨酸标准溶液、2.0mL水，在 100 ℃条件下水浴加热 10、12、14、15、16、18、20min，冷却10min，加水定容至25mL。分别测其570 nm 处吸光度值。结果如图3 所示：吸光度数值先增大后下降，在15 min 处达到最大吸光度值。

图3 加热时间对谷氨酸溶液吸光度的影响

（4）冷却时间的影响。

取6 支25 mL的比色管，分别加1mL的pH8 的缓冲盐溶液与1.0 mL 茚三酮溶液、2.0 mL谷氨酸标准溶液、2.0mL水，在100 ℃条件下水浴加热 15min。分别冷却 6、8、10、12、14、16min，加水定容至25mL。分别测其570 nm 处吸光度值。结果如图4 所示：吸光度随者冷却时间的延长先增大后降低，在冷却10 min 处达到最大值。

图4 冷却时间对谷氨酸溶液吸光度的影响

2.氨基酸标准曲线绘制。

取 7 支 25 mL 的比色管，分别加 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的谷氨酸标准溶液与1mL的pH 8 缓冲盐溶液、1.0 mL茚三酮溶液、加水至容积为6mL，在100 ℃条件下水浴加热15min，分别冷却15min，加水定容至25mL。分别测其570 nm 处吸光度值。绘制谷基酸标准曲线，计算回归方程和相关系数。

以标准谷氨酸浓度为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。从图5 可知，谷氨酸溶液浓度与吸光度呈线性相关，其回归方程为y=0.0035x-0.1859，相关系数R2=0.9996。