结核分枝杆菌感染的免疫学检测技术研究进展及临床应用现状

贾红彦 董静 张宗德 潘丽萍

据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估算，全球约1/4的人口感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[1]。我国是结核病高负担国家之一，MTB感染比例较高，约为20%[2-3]。WHO呼吁2035年消除结核病需要对结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)进行干预。然而，LTBI的诊断仍缺乏金标准，免疫学检测技术是实现MTB感染诊断的主要方法。此外，结核病的确诊需要依靠病原学实验室检查，但并非所有结核病患者都能够获得病原学诊断依据。据2018年数据统计，我国肺结核患者的病原学阳性率不足40%，肺外结核病原学阳性率更低[4]。根据最新的《肺结核诊断》行业标准，依赖于免疫学检测的MTB感染诊断结果已经成为重要的结核病辅助诊断依据。

宿主免疫系统与MTB的相互作用决定了MTB感染机体的结局。MTB入侵宿主后引发的免疫病理反应及抗结核免疫应答反应是开发免疫学诊断技术的基础，参与免疫应答不同阶段(天然免疫和适应性免疫)的各类细胞亚型、细胞因子、趋化因子、抗体等，都是潜在的免疫学诊断靶标。笔者主要对已经应用于临床实践的免疫学诊断技术原理、应用现状，以及处于研发和探索阶段的免疫学诊断技术的预期应用潜力进行简要概述。

一、应用于临床的MTB感染检测技术

1. 血清学诊断：血清学诊断是以宿主感染MTB后的体液免疫应答为基础，检测MTB抗原或抗体，主要基于酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫胶体金渗滤法、胶体金免疫层析法、蛋白芯片技术等。由于具有操作简单快速、实验技术要求低、价格低廉等优点，曾经是我国结核病诊断的重要辅助手段。但是，2011年WHO对94项商业化结核病血清学检测试剂盒进行了系统评估，认为血清学检测试剂的敏感度(0%～100%)和特异度(31%～100%)变化巨大，存在大量假阳性或假阴性结果，故不推荐使用[5]。WHO的上述建议直接影响血清学诊断在临床中的应用。血清学诊断不确定性的原因复杂，可能与抗原选择及生产工艺差别有关。

目前，有多项研究提示结核抗原检测对于结核病的诊断是有价值的，包括脂阿拉伯甘露聚糖抗原(lipoarabinomannan，LAM)、早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigentic target 6，ESAT-6)、培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)、Ag85抗原复合物及MPT64抗原等[6]。国际研发的基于LAM抗原的侧向流动型尿液检测，在HIV感染人群中诊断敏感度较高，而且随着CD4+T细胞数量降低，诊断敏感度优势越发明显[7]。WHO根据国际多中心研究数据分别于2015年和2019年制定和修订了关于尿液LAM检测的建议，推荐在HIV感染人群中使用。

WHO虽然在2011年否定了当时商业化血清学诊断试剂盒的应用，但并未限制结核新型抗原和新的诊断标识物的研究，当前的临床诊断现状也迫切需要发现新型抗原和分子标识物。通过客观准确的鉴定和评价体系筛选合适的抗原或抗原组合是未来血清学检测发展的方向和关键[8-9]。

2. 皮肤试验：结核菌素皮肤试验(tuberculin test，TST)基于迟发型超敏反应，已沿用上百年。在未出现更先进的免疫学诊断技术前，TST检测是检测MTB感染的重要工具，也是结核病的重要辅助诊断工具。但是，由于传统的结核菌素使用结核菌素纯蛋白衍生物，因此容易与卡介苗或非结核分枝杆菌产生交叉反应，导致特异度低。研究提示，在未接种卡介苗的人群中，TST检测的特异度可以达到97%，但在接种卡介苗的人群中，TST检测的特异度仅为59%，临床应用受限[10]。

目前，国内外都在研发新型皮肤变态反应原。一项在南非开展的临床试验提示，新型C-Tb皮肤试验，使用ESAT-6和CFP-10抗原混合物，在结核病患者中的诊断敏感度(73.9%)与γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)持平(75.1%)，在健康人群中的特异度(99.3%)明显高于传统TST(76.9%)，与IGRA检测持平(100%)[11]。国内也有类似研究，将ESAT-6和CFP-10融合蛋白(EC)作为变态反应原，替代原来使用的结核菌素纯蛋白衍生物。临床试验提示，EC蛋白在诊断MTB感染中能够排除卡介苗干扰，优于传统TST，与IGRA检测结果有良好的一致性，已获得国内临床应用许可[12]。新型皮肤试验的研发为MTB感染诊断和结核病辅助诊断提供了新的方法。得益于其操作便利性和技术要求低等优点，更适合在结核病基层防控机构推广实施。

3. IGRA：IGRA是以宿主感染MTB后的细胞免疫应答为基础，通过检测MTB特异抗原刺激后释放 γ-干扰素(IFN-γ)的特异性淋巴细胞数量(酶联免疫斑点法，ELISPOT)或直接检测IFN-γ水平(酶联免疫吸附法，ELISA)来判断机体是否感染MTB，是目前诊断MTB感染的有效工具，也是诊断结核病的重要辅助工具。IGRA技术于2001年获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，延用至今，期间不断有进口试剂盒的更新换代和各类国产试剂盒的问世。

不同国家和地区也对该技术在各类人群中的诊断价值给予了较完善的评估。由于纳入MTB特异抗原ESAT-6和CFP-10，该技术能够排除卡介苗的干扰，对于MTB感染的诊断效果较好[13]。基于IGRA检测获得的全球及我国LTBI率均明显低于TST[2]。该技术在活动性结核病患者中的诊断敏感度优于TST检测，阴性预测值较好，但由于无法与LTBI进行鉴别，在结核病高负担国家中的诊断特异度较低，常用于结核病患者的排除，而非纳入。在结核病低负担国家，该技术的诊断敏感度和特异度均优于TST检测，对于活动性结核病的诊断帮助较大[14]。在结核病发病风险预测方面，尽管IGRA检测的阳性预测值、阴性预测值略高于TST检测，但依然无法准确预测结核病发病[15]。在儿童群体中，荟萃分析提示IGRA检测和TST检测基本一致，并未表现出更好的诊断性能，因此并不推荐以IGRA替代TST用于儿童结核病的辅助诊断[16]。但是，IGRA检测在HIV感染、自身免疫疾病和器官移植人群的诊断敏感度优于TST，临床实践中建议单用IGRA检测或者联用TST检测，优先使用基于ELISPOT方法的检测[13]。

IGRA检测主要适用于外周血检测，但也有研究探索了该技术在不同体液中的应用价值，发现基于ELISPOT方法的IGRA检测的诊断性能优于基于ELISA方法的IGRA检测[13,17]。近年来，有研究提出可应用IGRA检测中结核特异抗原免疫应答与阳性抗原免疫应答的比值(TBAg/PHA ratio)作为鉴别活动性结核病和LTBI的指标，但仍需要基于前瞻性大样本队列对该比值进行进一步评价[18-19]。在临床实践中，存在一定比例(5%～20%)的确诊结核病患者的IGRA检测结果为阴性，原因比较复杂，包括高龄、HIV感染、免疫抑制状态、疾病进程、外周血淋巴细胞数量低、体质量指数(BMI)和人类白细胞抗原(HLA)分型等，其中外周血淋巴细胞数量低主要影响基于ELISA方法的IGRA检测结果[20]。

当前也有一些研究试图通过改变IGRA检测中的特异性抗原，获得更好的诊断性能[21]。最近的一项研究在联用原有ESAT-6和CFP-10基础上，依次加入新抗原Rv3615c和Rv3879c，虽然敏感度较结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)有所提升，但特异度也相应下降，并没有表现出更好的诊断性能[22]。QuantiFERON-TB Gold plus诊断试剂纳入了针对CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答的抗原，希望提升诊断敏感度，实现不同感染状态的鉴别诊断。但基于目前对其价值评估的荟萃分析数据，并没有体现出鉴别诊断结核病和LTBI的能力，但其诊断结核病和MTB感染的敏感度略高于其他QuantiFERON-TB诊断试剂[23-24]。对于改良型IGRA检测的研究，未来可能需要尝试更多的新型抗原。

4. 干扰素诱导蛋白-10(interferon gamma-induced protein 10，IP-10)：在活动性结核病早期诊断标识物的研究中，发现结核病患者外周血中存在一种高表达的细胞因子，即IP-10。IP-10主要来源于单核/巨噬细胞和T淋巴细胞，是IFN-γ免疫应答通路中一个高表达的CXC家族趋化因子，与IFN-γ受到同一信号通路的调控[25]。

有研究证实，将QuantiFERON-TB Gold试剂盒(IGRA的一种)中的检测靶标替换成IP-10蛋白，也适合于MTB特异性细胞免疫反应检测[26]。荟萃分析提示，靶向IP-10蛋白检测用于诊断结核病的敏感度和特异度可达到86%(95%CI：80%～90%)和88%(95%CI：82%～92%)，对LTBI的诊断敏感度和特异度分别为85%(95%CI：80%～88%)和89%(95%CI：84%～92%)[27-28]。研究发现，在结核特异抗原刺激后2.5～8 h内，IP-10 mRNA的表达量显著上调，上调倍数明显高于IFN-γ，而且能在较长时间内保持稳定的高表达。因此，IP-10 mRNA可能更适合作为MTB特异性细胞免疫反应检测的靶标[29]。

目前，国内外关于IP-10 mRNA检测用于MTB感染诊断或结核病辅助诊断的研究有限。国外一项研究平行比较了IGRA检测、IP-10蛋白检测和IP-10 mRNA检测在MTB感染中的诊断价值，发现结核特异抗原刺激后的IP-10 mRNA检测的诊断特异度与IGRA检测和IP-10蛋白检测基本一致，但是敏感度略低于其他两个靶标[30]，这可能与结核抗原刺激时间的选择以及RNA提取方案有关。通常情况下，mRNA转录窗口期较短，较长时间的抗原刺激后可能已进入IP-10蛋白累积阶段，mRNA含量下降。因此，锁定恰当的结核抗原刺激时间，捕获处于高表达状态的mRNA对于提高检测性能至关重要。国内也有研究分析了IP-10 mRNA 的检测性能，以结核特异抗原刺激后4 h作为检测时间点，IP-10 mRNA检测与IGRA检测在诊断MTB感染中获得了基本一致的敏感度和特异度，在HIV与MTB双重感染者中表现出更高的诊断敏感度和更低的不确定结果获得率[25,31]。

5. IFN-γ/白细胞介素(IL)-2双因子检测：IL-2是重要的Th1类细胞因子之一，既往研究发现，结核抗原刺激外周血淋巴细胞后，MTB感染者中IL-2表达量较未感染者明显升高。荟萃分析提示，在IFN-γ基础上增加IL-2检测可以提高MTB感染的检出率[32]。Suzukawa等[33]发现，包括IFN-γ和IL-2在内的多个细胞因子均与结核病相关，且联合检测IFN-γ和IL-2的受试者工作特征曲线下面积(AUC)大于其他因子的联合检测结果。这些研究均提示IFN-γ和IL-2 联合检测可以提高结核病的检出率。

然而，关于IFN-γ和IL-2联合用于活动性结核病和LTBI鉴别诊断的价值，一直存在争议。有研究认为，IGRA检测上清中IFN-γ/IL-2比值有助于鉴别诊断结核病和LTBI[34]，也有研究发现长时间刺激后(72 h)增加IL-2检测可帮助鉴别诊断结核病和LTBI[35]。也有一些不一致结果，显示联合检测IFN-γ和IL-2并不能鉴别诊断结核病和LTBI[36]。国内2020年上市的IFN-γ/IL-2双因子检测试剂盒，在常规IGRA检测中增加IL-2检测，临床试验数据提示增加IL-2可提高MTB感染的诊断敏感度，但未提及关于结核病和LTBI的鉴别诊断。因此，对于IFN-γ和IL-2联用的价值，尚需要在前瞻性大样本中做进一步评估。此外，国外开发的基于Ala-DH抗原刺激下的IL-2检测试剂，在成人和儿童的活动性结核病和LTBI鉴别诊断中表现出较好的敏感度(100%)和特异度(96%和81%)，提示开发基于新型结核抗原刺激下的多因子检测，可能有希望实现活动性结核病和LTBI的诊断[37-38]。

6. B细胞ELISPOT检测：B 细胞ELISPOT可用来直接计数抗体分泌细胞和长期记忆B细胞，是分析抗体免疫反应的有力工具，并且是仅有的少数能直接聚焦于抗体分泌细胞(antibody-secreting cell，ASC)的分析方法之一。B细胞ELISPOT能在10万个细胞中实现对单个抗原特异性B细胞进行定量检测，因而具有极高的敏感度[39]。相对于常用的细胞流式检测技术而言，B细胞ELISPOT技术能够帮助研究人员识别样品中的ASC，并测量其总数以及那些对特定抗原分泌抗体的细胞数量，目前主要用于检测B细胞对感染的反应和疫苗引发的反应。研究表明，卡介苗接种人群中由卡介苗引发的MTB特异的记忆性B细胞比例明显高于未接种者[40]。在MTB感染及结核病的诊断中，相对于T细胞介导的细胞免疫而言，对B细胞及其抗体在结核免疫中作用的研究相对较少。早期研究发现，活动性结核病患者中存在功能缺陷的B细胞亚群，表现为增殖受限、抗体及细胞因子释放受损等，提示B细胞在结核病免疫应答中起着重要作用[41]。Gindeh等[42]利用B细胞ELISPOT技术研究发现结核病患者外周血中ESAT-6/CFP-10特异的浆母细胞比例明显高于密切接触者及LTBI者，而且在抗结核治疗后明显降低，提示B细胞ELISPOT技术用于诊断结核病的潜在价值。另一项研究也提示活动性结核病患者中存在较高水平的卡介苗特异的IgG+浆母细胞，其与LTBI者和非结核病患者间的比例差异明显，可作为活动性结核病诊断的分子标识[43]。但是由于目前关于B细胞各亚群在宿主抗结核免疫应答中的作用并未完全阐明，因此目前B细胞ELISPOT检测技术用于结核病诊断的价值研究仍然需要进一步深入探讨。

二、新型MTB感染检测靶标和技术的研发进展

1. 细胞因子检测：新的诊断技术需要新的靶标，国内外研究者一直致力于探寻除IFN-γ之外的其他因子，希望通过单独或综合检测的方式来提高结核病或MTB感染的诊断能力。到目前为止，纳入评估的细胞因子超过100种，包括白细胞介素类(IL1α/β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27等)、趋化因子类(CXCL家族、CXCR家族、MIP-1α/β、MCP、RANTES、I-309 等)，以及其他细胞因子(TNF-α、VEGF、GM-CSF、G-CSF、MMP-9、TGF-β等)。一项荟萃分析对56项研究进行了综合分析，其中研究最多的是IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10、IL-10和IL-13。尽管多数研究认为各类细胞因子具有鉴别诊断结核病和LTBI的潜质，但各研究之间的异质性很高，并没有得到非常统一的结果[44]。分析原因，可能与各研究入组人群、研究设计、样本性质及检测方法有关。未来针对结核抗原特异细胞因子的研究，应该基于更加成熟的设计，分别在儿童和成人群体中单独分析。

2. 多功能淋巴细胞亚型：细胞免疫应答在MTB感染引起的宿主适应性免疫应答过程中起到重要作用。结核抗原刺激后的T淋巴细胞，因分泌多种细胞因子而被认为是多功能细胞(poly-functional T cells)，表现为不同的细胞亚型和功能。在结核病研究中发现，分泌不同细胞因子的多功能T细胞亚型的数目和比例可能与不同的MTB感染状态相关[45]。早在2011年，Harari等[46]发现，单分泌TNF-α的CD4+T细胞数目在LTBI和活动性结核病中的比例存在明显差异，而且在治疗后明显降低，可能是鉴别诊断活动性结核病和LTBI的标识物。Rozot等[47]构建了基于单分泌TNF-α的CD4+T细胞比例和结核抗原特异的CD8+T细胞数目的诊断模型，可用于活动性结核病和LTBI的鉴别诊断。其后多项研究提示，针对释放IFN-γ和TNF-α的多功能淋巴细胞检测有助于活动性结核病和LTBI的诊断和鉴别诊断[48-49]。也有研究发现，释放IFN-γ并表达CD38、HLA-DR、Ki-67蛋白的CD4+T细胞能够鉴别诊断活动性结核病和LTBI，而且可能作为监测治疗效果的标识物[50]。目前看来，应用流式细胞仪或者多色免疫荧光技术检测特异性抗原刺激后释放多种细胞因子的淋巴细胞亚型，对于实现MTB感染的诊断，甚至是活动性结核病和LTBI的鉴别诊断可能具有较好的意义，但至今尚无相关的诊断试剂用于临床实践[51]。

3. 新型生物标识物：通过蛋白质组学技术系统筛选活动性结核病和LTBI的宿主免疫应答标识物，是开发新型免疫学检测技术的重要源动力。2006年，Agranoff等[52]率先采用表面增强激光解析飞行时间质谱技术筛选获得了结核病血浆特异蛋白，并基于支持向量机数学模型构建了由20个蛋白组成的结核病诊断模型。到目前为止，全球研究者开展了至少20余项结核病高通量特异蛋白组研究，筛选获得了上百种宿主蛋白，具有结核病诊断和鉴别诊断的潜在价值，近5年就有10余项研究(表1)。然而，早期的大多数研究止步于系统筛选阶段，近年来的少数研究才开展了诊断模型构建和盲法验证，但仍无确定的生物标识物达到临床应用阶段。其中比较有代表性的包括：De Groote等[53]应用不同数学模型在722个候选蛋白中获得了一组蛋白诊断模型，在三组不同人群中分别获得了较好的诊断价值(AUC为 0.89～0.94)；Yang等[54]开展了一项基于蛋白芯片中640个蛋白的筛选和验证，最终获得了一组由8个蛋白组成的、可有效区分结核病和LTBI，以及结核病和非结核肺部疾病的结核病诊断分子标识组合；Sun等[55]建立了一组由3个蛋白组成的、可用于结核病和LTBI鉴别诊断的标识组合。但是，所有这些数据在应用于临床实践之前，均需要更加严格的多中心、多人群独立验证。

表1 结核病特异蛋白标识的研究汇总

三、展望

近年来，结核病免疫诊断技术的研发取得了巨大进展，特别是在IGRA技术之后，相继出现了基于IP-10检测和IL-2检测的MTB感染诊断新技术，一方面提高了MTB感染的检出率，另一方面在免疫低下等特殊人群中表现出较好的诊断价值。尽管这些新型的细胞免疫检测技术仍然无法实现活动性结核病和LTBI的鉴别诊断，但足以提示除IFN-γ外，必然存在其他细胞因子或标识物能够指示MTB的不同感染状态。随着对MTB感染后宿主免疫应答机制的深入探讨，必然能够找到更理想的生物标识物，以提高MTB感染和结核病免疫学诊断的敏感度和特异度。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献贾红彦：文献查阅、起草文章初稿；董静：文献查阅；张宗德：稿件审阅修改；潘丽萍：文献审阅、初稿修改及审校