黄瓜白粉病拮抗放线菌的筛选、鉴定及活性评价

王海利，张晓慷，王滢秀，蒋爱忠，韩金涛，左伯军，张新刚

(山东省农药科学研究院，济南 250000)

白粉病(Sphaerotheca fuliginea)是黄瓜在大棚栽培过程中常见的病害之一，直接影响黄瓜叶片的光合作用，在黄瓜生长后期发生严重时引起产量损失50%以上，甚至绝产[1]。当前，白粉病主要依靠化学杀菌剂来防治，其已对多种药剂产生不同程度的抗药性，且发展速度极快。因此，寻求高效、安全及环境友好的生物防治药剂已成为国内外黄瓜白粉病防治研究的新趋势[2]。

放线菌广泛分布于自然界中，能产生丰富的代谢产物，其中许多活性物质对细菌和真菌性病害具有较好的防治效果，被广泛应用于医药、农业等各个领域[3]。由于其具有生产工艺简单、原料不具腐蚀性、设备安全耐用、几乎不产生污水等优点，因此对于保障人们的生命与健康和保护生态环境都十分重要，并将极大地增强我国农产品的国际竞争力[4]。

本试验旨在通过对黄瓜根际土壤放线菌株的分离、纯化、鉴定和活性筛选，发掘对瓜类白粉病防效较好的菌株，以期为下一步田间药效试验评价和开发出生产上具有较好竞争力的产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

ZWY-2112B摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)；SPX-150B-Z型恒温震荡培养箱、SW-CJ-1FD洁净工作台、YXQ-LS-50S11高压蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；TD5M离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；C22-RT22E01美的电磁炉(美的集团)；KDM型1升电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；HZT-A2000电子秤(华志电子科技有限公司)。

葡萄糖、可溶性淀粉(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、琼脂(分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司)；NaCl、KH2PO4、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 试验材料

1.2.1 供试作物

黄瓜(Cucumis sativusL.)，易感病品种名称为宝杨5号，购自于上海市种子市场。

1.2.2 供试致病真菌

黄瓜白粉病病菌(Sphaerotheca fuliginea)、水稻纹枯病病菌(Thanatephorus cucumeris)、小麦赤霉病病菌(Gibberella zeae)、番茄早疫病病菌(Alternaria solani)、草莓灰霉病病菌(Botrytis cinereaPers.)、水稻恶苗病病菌(Gibborella fujikuroi)、水稻稻瘟病病菌(Pyricoraria orizae)，均是本实验室保存备用。

1.2.3 培养基

菌种分离筛选培养基[5]：高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，自来水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

菌种活化培养基(日本培养基)：可溶性淀粉5 g，葡萄糖5 g，蛋白胨1 g，牛肉膏1 g，酵母膏1 g，琼脂15 g，自来水1 000 mL，pH 7.2。

菌种发酵培养基(C4培养基)：可溶性淀粉10 g，葡萄糖20 g，花生饼粉25 g，牛肉膏1 g，酵母粉4 g，氯化钠2 g，磷酸氢二钾0.05 g，自来水1 000 mL，pH 7.2。

1.2.4 对照药剂

20%吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)悬浮剂(利民化工股份有限公司)；50%多菌灵(carbendazim)可湿性粉剂(上海悦联化工有限公司)

1.3 试验方法

1.3.1 拮抗放线菌的分离纯化

采用梯度稀释平板涂布法分离黄瓜根际土壤中的放线菌[6]：

⑴ 根据配方制作高氏一号培养基，趁热将适量培养基注入培养皿中，待凝成平板，备用。

⑵ 称取黄瓜根际土壤约10 g，放入装有100 mL无菌水和玻璃珠的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌的生长。摇床振荡10 min左右，制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。

⑶ 用移液枪吸取0.1 mL 10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃棒将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于28 ℃培养箱中，培养7～10 d，培养基上会出现适量微生物菌落。如果菌落硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

⑷ 挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。

1.3.2 种子菌液的制备

将分离保存的菌种转接到 C4培养基平板上，28 ℃培养48 h进行活化，活化后挑取部分菌落接于装有100 mL C4培养基的250 mL锥形瓶中，28 °C，180 r/min，振荡培养48 h即为种子菌液。

发酵液的制备：将发酵好的种子液按5% (体积比)的比例接种到装有200 mL C4培养基的500 mL锥形瓶中，28 ℃，180 r/min振荡培养96 h备用。

1.3.3 拮抗放线菌的筛选

1.3.3.1 初筛

初筛采用含毒介质法[7]，具体步骤：⑴ 先将配制好的PDA培养基基质加热至沸腾；⑵ 向已经经过高温消毒处理的培养皿加入1 mL样品发酵液，混合均匀；⑶ 向培养皿中加入10 mL PDA培养基基质，冷却至室温，紫外灭菌至少30 min；⑷ 在培养基中心位置分别放置倒置的水稻纹枯病、小麦赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻恶苗病或水稻稻瘟病的病原菌菌饼(d=8 mm)；⑸ 将制备好的培养皿倒置放在28 ℃培养箱中培养(放在盒子中或者用报纸包好保存，防止被培养箱中热风吹干)。其中以不放置致病菌菌饼作为对照试验、50%多菌灵可湿性粉剂做为阳性对照试验。每组试验3个重复。28 ℃恒温培养箱中培养，待对照组的病原菌菌丝体铺满整个平板时，测量试验组病菌直径，计算抑菌率。计算公式为：

1.3.3.2 复筛

对初筛试验中效果较好(抑菌率＞60%)的拮抗菌进行复筛。以黄瓜白粉病菌为指示菌，采用活体生测法，筛选对其有效的拮抗菌株。在温室条件下，挑选饱满的黄瓜种子播种到小花盆里，保湿，置于25 ℃室温下光照培养。待黄瓜幼苗长出2片真叶时，挑选长势一致的黄瓜苗，将初筛的放线菌发酵液4 000 r/min进行离心处理15 min，上清液原液及其2倍稀释和4倍稀释药液分别均匀喷洒于叶片上，待药液晾干后接种孢子浓度为10万个/mL左右的白粉病菌孢子悬浮液，用接种喷雾器在黄瓜苗上均匀喷雾接种，然后把接种白粉病菌的黄瓜苗移至恒温室灯光下(24 ℃左右)，培养期间每天保温、保湿，于7 d和14 d后按黄瓜白粉病的常规分级标准及方法计算病情指数和防治效果[8]，每处理3次重复。对照药剂为吡唑醚菌酯悬浮剂，以清水作为空白对照。

1.3.4 拮抗放线菌株的观察与鉴定

1.3.4.1 拮抗放线菌株的培养性状与形态特征

对复筛试验中拮抗活性最强的放线菌，用活化培养基进行培养，在培养过程中观察菌落形态，并对菌落进行革兰氏染色，观察染色后的颜色。

1.3.4.2 拮抗放线菌株的鉴定

拮抗放线菌株的16S rDNA片段的扩增与序列分析采用通用引物27F和1492R进行PCR扩增[9]。正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、反向引物：5'-ACGGCTACCTTGTTA CGACT-3'。PCR产物由山东圣强德生物技术有限公司测序，结果在Genbank中进行 Blast同源序列检索。将所测得的16srDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性比对，应用Clustal X进行多重比对后，根据MEGA5.0软件采用Neibor-Joining方法构建系统发育树[10]，自举分析10 000次重复检测分子系统树的置信度，最后确定该菌株的分类地位。

1.4 数据分析

用Excel软件进行数据统计性分析，用Minitab Statistical Software软件进行差异性显著分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的分离筛选和初筛结果

采用梯度稀释平板涂布法从黄瓜根系土壤中共分离得到放线菌108株，通过离体生测方法测定了这些放线菌对水稻纹枯病、小麦赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻恶苗病、水稻稻瘟病的6种致病菌的抑制活性，发现具有广谱防效的菌株占17%，拮抗能力均在50%以上的菌株只占5%左右，有较弱拮抗作用的菌株占8%，其余均无活性。

选取拮抗能力最强的一株放线菌菌株编号为SDNY-040，再次进行离体生测试验验证，结果显示，与清水对照相比，SDNY-040对水稻纹枯病、小麦赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻恶苗病、水稻稻瘟病病原菌的抑菌率均超过90%，较50%多菌灵可湿性粉剂对番茄早疫病和草莓灰霉病的防效分别高86.2%和38%，说明该株放线菌具有广谱的抗真菌能力。结果见表1。

表1 SDNY-040的离体抑菌效果

2.2 放线菌株SDNY-040复筛结果

盆栽测定结果显示，放线菌株SDNY-040发酵液原液以及2倍稀释和4倍稀释药液在施用7 d后，白粉病病情指数分别为2.7、3.7和3.7，药剂防效分别为95.7%、93.2%和93.2%，施药后第14 d时3个施药浓度的病害病情指数分别为8.3、11.1和22.2，药剂防治效果分别为87.9%、83.9%和67.7%。与20%吡唑醚菌酯悬浮剂相比，原液在第7 d和14 d时的防效要低4.3%和13%，防治效果与清水相比，均呈显著性差异，说明此拮抗放线菌的防效比较显著。结果见表2。

表2 放线菌SDNY-040对盆栽黄瓜白粉病防治效果

2.3 放线菌株SDNY-040的形态特征

放线菌株SDNY-040革兰氏染色呈阳性，在日本培养基上生长较缓慢，单菌落呈皱褶状，基内菌丝呈褐色，发酵液呈褐色，上清液澄清透明，具备生产、储藏以及应用上的优势。

2.4 放线菌株SDNY-040的16s rDNA的序列分析和系统发育树构建

经测序，放线菌株SDNY-040的16s rDNA全长序列1 408 bp，在GenBank数据库中进行Blast比对，结合进化树分析，结果显示其与紫色链霉菌(Streptomycessp.)亲缘关系最近，同源性达到99%以上，结合菌落形态特征，可以初步判断放线菌株SDNY-040是链霉菌属相关变种，系统进化树见图1。

图1 基于16s rDNA序列同源性的SDNY-040和相关菌属的系统发育树

3 结 论

大多数天然存在的抗生素来源于放线菌，放线菌素是人们在1940年首次发现来源于链霉菌的抗生素，由抗生素链霉菌产生[11]，1942年发现了由淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)产生的链丝菌素，1944年发现了由灰色链霉(Streptomyces griseus)产生的链霉素(streptomycin)。链霉菌一直是临床抗生素的主要来源，其中放线菌源的抗生素有80%以上的来源于链霉菌[12]。

本文通过对黄瓜根际土壤菌进行分离纯化，以离体试验进行大范围初筛，发现了一株具有对水稻纹枯病、小麦赤霉病、番茄早疫病、草莓灰霉病、水稻恶苗病、水稻稻瘟病病原菌抑菌率均在90%以上广谱杀菌放线菌株，且对黄瓜白粉病具有较高的生防效果。经分子生物学鉴定推测该菌与紫色链霉菌属(Streptomycessp.)属于同一属，具有较好的市场开发潜力。