家蚕丝腺中Abd-A 3 种剪接体的克隆、序列分析及原核表达

路庆君，罗竹星，刘华伟，魏 梦，王 圆，张照锋，李游山，

（1. 陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；2. 陕西理工大学秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室（培育），陕西 汉中 723001；3. 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716）

家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目的典型昆虫，由野蚕驯化而来，是以桑叶为食、吐丝结茧的重要经济昆虫。蚕的经济价值在于蚕丝，而丝腺是家蚕高效合成和分泌丝蛋白的重要器官[1]。丝腺从形态和功能上主要分为吐丝部、前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺[2]，后部丝腺合成丝素蛋白，中部丝腺合成丝胶蛋白，二者合成分泌的蛋白质共同进入前部丝腺发生构象变化后到达吐丝部，最终形成蚕丝[1]。家蚕发育至5 龄期时，食桑量大幅增加，大量合成丝蛋白[3]。丝腺的蛋白质组学研究还鉴定到丝腺腔内容物中含有氧化还原酶、蛋白激酶、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、表皮蛋白、转运蛋白、转录因子等多种物质[4]。目前已发现有大量转录因子参与调控丝腺发育、丝蛋白基因转录表达、丝腺细胞凋亡等生命过程[5]。研究表明，丝蛋白合成过程中有多种调节因子参与，如SGF-B、BmFA、Ub2a和Ub2b复合体、TRIO 复合体、PSGF调节蛋白等丝腺特异转录因子[6]。

前人研究表明，多数种类昆虫的组织部位是由同源基因决定的[7]。家蚕丝腺的分化受到Dfd、Scr、Antp、Ubx、eve等同源异型结构域基因的调节[2]。Dfd、Scr、Antp、Ubx都属于Hox基因，Hox基因是同源异型盒（Homeobox）家族的成员之一，它们沿着昆虫身体前后轴指定的区段顺序排列[8]，是一类专门调控生物形体的基因。果蝇中Hox基因包括触角复合体（Antennapedia complex，ANT-C）和双胸复合体（Bithorax complex，BX-C）两大类群，ANT-C 包括Dfd、Scr、Antp、Lab、Pb基因，主要负责果蝇头部和前胸部的体节分化、器官形成及功能调控；BX-C 包括Ubx、Abd-A和Abd-B基因，主要负责果蝇后胸部和腹部的体节分化、器官形成及功能调控[9‐13]。其中，转录因子Abd-A 广泛存在于多个物种中，最早在果蝇中发现存在7种剪接体，参与果蝇第2至第8腹节的形成，主要调控前后体节轴分化、生殖腺和脂肪体发育及中肠的形成等生理过程[14‐17]。Abd-A 还参与调控鳞翅目、半翅目等昆虫中色素沉着模式的形成[18‐19]。家蚕转录因子Abd-A 至少有3 种剪接体，能够影响家蚕胚胎早期发育，参与调节第3 至第6腹节的发育和腹足的形成[20]，还参与调控变态发育期间翅形成相关成虫盘的分化和发育[21]。

已有研究表明，参与调控丝蛋白基因表达的转录因子多属于HOX 和FOX 家族[22]，而属于HOX 家族的转录因子Abd-A 也可能参与丝蛋白基因表达，或丝腺中其他相关基因的表达调控。目前，转录因子Abd-A 在家蚕胚胎发育以及变态发育过程中所发挥的功能研究较为丰富，但对于Abd-A 在丝腺中生理功能的认识还十分有限，家蚕丝腺中Abd-A 的剪接体形式及在生物进化中的地位尚未全面阐述。为此，从家蚕丝腺中克隆转录因子Abd-A 的不同剪接体，利用生物信息学方法对其序列进行比对分析以及空间结构预测，构建不同昆虫Abd-A 的系统发育树，明确其进化地位，并对转录因子Abd-A 进行原核表达，为后续探究Abd-A的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试家蚕为非滞育品种D9L，由陕西理工大学生物科学与工程学院保存。家蚕在自然光照条件下以新鲜桑叶进行饲养，饲养温度为25 ℃，相对湿度为（75±5）%。收集若干5 龄第6 天家蚕的前部、中部、后部丝腺组织，液氮速冻处理后置于-80 ℃冰箱保存。pSL1180载体、pCold-SUMO 载体均由西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心提供。

1.2 试剂

TRIzol 试剂购自Invitrogen 公司；M-MLV 反转录酶购自Promega 公司；限制性核酸内切酶BglⅡ、NotⅠ、KpnⅠ、HindⅢ均购自Takara 公司；TransStart FastPfuDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、Trans2K PlusⅡ DNA Marker、EasySeeWestern Marker（25～90 ku）、抗His 标签鼠单克隆抗体、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白质Marker（14.4～116 ku）、HRP 标记山羊抗小鼠IgG（H+L）购自上海碧云天生物技术有限公司；超敏型ECL 化学发光试剂盒购自Thermo Fisher Scientific 公司；DH5α 感受态细胞购自上海昂羽生物技术有限公司；宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）、Isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）、SDS-PAGE电泳相关试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 家蚕丝腺中Abd-A 的克隆 以Abd-A、silkworm 为关键词，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行检索，下载家蚕Abd-A L的mRNA 序列（GenBank 登录号：AB461860），基于BmAbd-A L的编码区序列设计引物，正向引物：5´-GAAGATCTATGGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGA‐GGATCTGAGTTCCAAGTTCATCATCGATAGCAT-3´（双实线为引入的BglⅡ酶切位点，单虚线为引入的c-Myc 标签对应的编码序列），反向引物：5´-ATTTGCGGCCGCTTACGTGGGGACCTTGTTCACTT-3´（双实线为引入的NotⅠ酶切位点）。使用TRIzol 试剂分别提取5龄第6天家蚕的前部丝腺（ASG）、中部丝腺（MSG）、后部丝腺（PSG）总RNA，并利用MMLV 反转录酶合成cDNA[23]。分别以前部、中部、后部丝腺组织cDNA 为模板，采用以下程序进行PCR扩增：95 ℃2 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃1 min，35 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分离，经过切胶、酶切回收后，将目的片段连接至pSL1180 载体中，转入大肠杆菌DH5α 菌株，菌液PCR 筛选获得阳性克隆后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.2 不同昆虫Abd-A 的多序列比对 将1.3.1 中克隆的家蚕Abd-A 剪接体BmAbd-A L（A59T）编码的氨基酸序列在NCBI 中进行BLAST 分析，下载其他昆虫的Abd-A 编码的氨基酸序列，与克隆的BmAbd-A L（A59T）编码的氨基酸序列通过ClustalX 1.81 软件进行多序列比对。最后将多序列比对结果导入软件GeneDoc程序中进行展示。

1.3.3 不同昆虫Abd-A 的系统发育树构建 以Abd-A 为关键词，在NCBI 中进行检索，下载昆虫纲中代表性物种的Abd-A 剪接体编码的氨基酸序列（表1），利用MEGA 5.02软件中的邻接法（Neighborjoining 法）构建系统发育树，并使用1 000 次bootstrap重复来评估拓扑的准确性[24]。

表1 不同昆虫Abd-A的序列信息Tab.1 Sequence information of Abd-A from different insects

续表1 不同昆虫Abd-A的序列信息Tab.1（Continued） Sequence information of Abd-A from different insects

续表1 不同昆虫Abd-A的序列信息Tab.1（Continued） Sequence information of Abd-A from different insects

1.3.4 家蚕Abd-A 的三维结构预测 分别选取BmAbd-A L（A59T）的Q186—K307 序列，BmAbd-A S 的Q186—K302 序列，BmAbd-A 3 的Q186—K298序列，通过PDB（https://www.rcsb.org/）比对搜索，选择与上述序列一致性高于80%的ultrabithorax（PDB登录号：4CYC）序列作为模板，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）同源建模在线软件构建Abd-A 的三维结构模型，并以QMEAN 值对模型进行评估，利用可视化软件PyMOL对结构模型进行展示。

1.3.5 家蚕丝腺中Abd-A 原核表达载体构建及诱导表达 以1.3.1中构建成功的重组质粒BmAbd-A L（A59T）-pSL1180、BmAbd-A S-pSL1180、BmAbd-A 3-pSL1180 为模板，设计原核表达引物，正向引物：5´-CGGGGTACCATGAGTTCCAAGTTCATCATCGA-3´（双实线部分为引入的KpnⅠ酶切位点），反向引物：5´-CCCAAGCTTTTACGTGGGGACCTTGTTCAC-3´（双实线部分为引入的HindⅢ酶切位点）。采用以下程序进行PCR 扩增：95 ℃2 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃10 min。参照1.3.1 中的方法将目的片段克隆至pCold-SUMO 表达载体中。将pCold-SUMO 载体（对照组）及重组表达质粒（试验组）转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株，在37 ℃、220 r/min 条件下培养至菌体OD600为0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L或0.5 mmol/L，16 ℃诱导表达20 h。6 000 r/min离心30 min收集菌体，用结合缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 值7.9）重悬菌体，经过超声破碎、离心，分别收集菌体上清和沉淀，然后利用12.5% SDSPAGE 进行电泳分离，最后用考马斯亮蓝进行染色。

1.3.6 Western blot 分析 将1.3.5 中诱导表达的上清样品用12.5% SDS-PAGE 电泳分离后，电转印迹至硝酸纤维素膜上。加入5%脱脂奶粉，4 ℃封闭过夜。分别以抗His 标签鼠单克隆抗体（1∶1 000）和HRP 标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶40 000）作为一抗和二抗，利用超敏型ECL 化学发光试剂盒显色，然后用化学发光成像系统进行曝光和拍照。

2 结果与分析

2.1 家蚕丝腺中Abd-A的克隆及序列分析

为探究转录因子Abd-A 在家蚕丝腺中的剪接形式，对Abd-A 进行了克隆，PCR 扩增结果显示，前部、中部、后部丝腺中分别扩增出1 000 bp左右的目的条带（图1A）。将前部、中部、后部丝腺中扩增出的目的片段混合后连接至pSL1180载体。菌液PCR检测结果显示，6 个克隆均出现1 000 bp 左右的条带，与预期大小一致（图1B）。经测序和序列比对，发现家蚕丝腺中至少存在3种不同的Abd-A mRNA剪接体，它们的编码区全长分别为1 059、1 044、1 032 bp（图1C）。与编码区为1 059 bp 的剪接体相比，编码区为1 044 bp 的剪接体缺少第605—619 区（编码氨基酸为DFPFP），编码区为1 032 bp 的剪接体缺少第605—619 区和第652—663 区（编码氨基酸为GEFN）。需要指出的是，编码区为1 044、1 032 bp的剪接体在第174—175区的碱基为GG，而编码区为1 059 bp 的剪接体在此区的碱基为AA。进一步将3 种剪接体编码的氨基酸序列在NCBI 中进行比对，发现编码区为1 044、1 032 bp 的剪接体编码的氨基酸序列分别与已公布的家蚕Abdominal-A isoform S 和Abdominal-A isoform 3 的序列一致，故命名为BmAbd-A S、BmAbd-A 3；编码区为1 059 bp的剪接体编码的氨基酸序列与家蚕Abdominal-A isoform L 的序列在第59 位氨基酸有差异，该剪接体编码蛋白质的第59 位氨基酸由Ala 突变为Thr，将其命名为BmAbd-A L（A59T）。

图1 家蚕丝腺中Abd-A的克隆及序列比对Fig.1 Cloning and sequence alignment of Abd-A from silk gland of B.mori

2.2 不同昆虫Abd-A的多序列比对

为了鉴定不同昆虫间的Abd-A 序列在结构或功能上的重要保守区域和差异性位点，选择菜粉蝶、中华蜜蜂、红火蚁、黑腹果蝇、埃及伊蚊、赤拟谷盗、萤火虫Abd-A编码的氨基酸序列与家蚕Abd-A L（A59T）进行多序列比对，结果如图2 所示。家蚕Abd-A L（A59T）的氨基末端序列与菜粉蝶、赤拟谷盗、萤火虫、中华蜜蜂、红火蚁、黑腹果蝇相似性较高，但与埃及伊蚊差异较大；其羧基末端序列与菜粉蝶、赤拟谷盗、萤火虫、中华蜜蜂、红火蚁相似性较高。从整体上看，这些昆虫的Abd-A 氨基酸序列差异较大，然而它们都具有Homeobox domain 和Abd-A domain 2 个重要结构域，其中Homeobox domain的氨基酸序列完全相同，该区域是DNA 结合所必需的结构域；Abd-A domain 的氨基酸序列羧基末端序列差异明显，该区域为Abd-A 的激活结构域，其主要作用为转录激活。

图2 不同昆虫Abd-A的多序列比对结果Fig.2 Multiple sequence alignment results of Abd-A from different insects

2.3 家蚕丝腺中Abd-A的3种剪接体的三维结构分析

为探究Abd-A 的3 种剪接体的空间结构差异，利用SWISS-MODEL 同源建模软件对Abd-A 的3 种剪接体编码的蛋白质进行三维结构预测。BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3 三维结构的QMEAN 值分别为0.64、0.59、0.61，它们的三维结构中均有4 个α 螺旋结构和无规则卷曲结构。BmAbd-A L（A59T）三维结构中，α1 螺旋由P195—M197 组成，α2 螺旋由R236—F248 组成，α3 螺旋由R254—L264 组成，α4 螺旋由E268—V289 组成（图3A）；BmAbd-A S 三维结构中，α1 螺旋由P195—S198 组成，α2 螺旋由R231—F243 组成，α3 螺旋由R249—L259 组成，α4 螺旋由E263—V284 组成（图3B）；BmAbd-A 3 三维结构中，α1 螺旋由P195—M197 组成，α2 螺旋由R227—F239 组成，α3 螺旋由R245—L255 组成，α4 螺旋由E259—V280 组成（图3C）。将Abd-A 的3 种剪接体编码蛋白质的三维结构进行比对，发现它们的α2 螺旋、α3 螺旋、α4 螺旋结构中的氨基酸组成相同，而α1螺旋结构之间具有差异，BmAbd-A L（A59T）与BmAbd-A 3 中的α1 螺旋结构均由3个氨基酸组成，BmAbd-A S 中的α1螺旋则由4个氨基酸组成。另外，α1螺旋与α2螺旋之间的无规则卷曲部分差异更大，与BmAbd-A S、BmAbd-A 3相比，BmAbd-A L（A59T）在此区域的无规则卷曲结构更灵活，更易于产生构象变化（图3D）。

图3 家蚕丝腺中Abd-A 3种剪接体编码蛋白质的三维结构Fig.3 Three-dimensional structure of proteins encoded by three spliceosomes of Abd-A in silk gland of B.mori

2.4 不同昆虫Abd-A的系统发育分析

为进一步研究家蚕丝腺中的3 种Abd-A 剪接体与其他昆虫Abd-A 的亲缘关系，选择了35 种昆虫的83 条Abd-A 序列（表1），构建不同昆虫Abd-A的系统发育树（图4）。从图4 可以看出，多数昆虫中的Abd-A 也存在不同剪接形式，其编码的氨基酸序列也各有差异，形成3个进化分支，膜翅目与鞘翅目聚为一支，双翅目、鳞翅目分别为独立的一支，基本符合物种的亲缘进化关系，说明Abd-A 的分子进化过程与物种系统进化一致。鞘翅目一支中，包括赤拟谷盗、瓢虫、萤火虫等7 个代表性物种，其中蜣螂的4 条Abd-A 氨基酸序列聚为独立的一支；膜翅目一支中，包括中华蜜蜂、红褐大齿猛蚁、红火蚁等13 个代表性物种；鳞翅目一支中，包括家蚕、大蜡螟、玉米螟等10个代表性物种，其中菜粉蝶、小斑草眼蝶、帕眼蝶、夏威夷红蛱蝶、黑脉金斑蝶、偏瞳蔽眼蝶的Abd-A 氨基酸序列聚为一支，家蚕、大蜡螟、玉米螟、海波斯莫科马属蛾的Abd-A 氨基酸序列聚为一支；双翅目一支中，包括橘小实蝇、黑腹果蝇、黑水虻、甘蓝瘿蚊、埃及伊蚊，其中橘小实蝇、黑腹果蝇、黑水虻、甘蓝瘿蚊的Abd-A 氨基酸序列聚为一支，埃及伊蚊的Abd-A 氨基酸序列单独聚为一支。家蚕的Abd-A 氨基酸序列与螟蛾科的大蜡螟在进化关系上更近，其次为玉米螟。

图4 不同昆虫Abd-A的系统发育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Abd-A from different insects

2.5 家蚕丝腺中Abd-A的原核表达

2.5.1 转录因子Abd-A 原核表达载体构建及诱导表达 以构建至pSL1180载体的3种Abd-A 剪接体的重组质粒为模板，扩增出含限制性核酸内切酶识别位点的目的片段BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3（图5A），然后将目的片段连接至pCold-SUMO 表达载体。菌液PCR 检测及测序结果显示，Abd-A 的3 种剪接体的原核表达载体构建成功（图5B）。将原核表达载体转化至BL21（DE3）菌株，以0.2、0.5 mmol/L 的IPTG 诱导表达，用12.5% SDSPAGE 电泳分离检测。BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3编码蛋白质的理论分子质量分别为38.31、37.68、37.23 ku，它们表达的携有6×His-SUMO 标签融合蛋白的理论分子质量分别为52.99、52.35、51.91 ku。图6 结果显示，0.2、0.5 mmol/L IPTG 诱导的菌体上清中均检测到1 条52 ku 左右的蛋白质条带，与预期大小基本一致，表明Abd-A 的3种剪接体的融合蛋白均以可溶形式表达。同时，在对照组菌体上清中检测到6×His-SUMO标签蛋白的表达条带，其理论分子质量为16.29 ku。

图5 家蚕丝腺中Abd-A的原核表达载体构建Fig.5 Construction of prokaryotic expression vectors of Abd-A from silk gland of B.mori

2.5.2 转录因子Abd-A 重组蛋白的Western blot分析 利用Western blot 进一步分析Abd-A 的3 种剪接体重组蛋白的表达情况。图7结果显示，Abd-A的3 种剪接体重组蛋白均能与抗His 标签鼠单克隆抗体发生结合反应，在40～60 ku 处各检测到1 条特异蛋白质条带，与目的蛋白大小一致，表明蛋白质条带分别为BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3重组蛋白。

图7 Abd-A的3种剪接体重组蛋白的Western blot分析Fig.7 Western blot analysis of recombinant proteins of three Abd-A spliceosomes

3 结论与讨论

本研究发现，Abd-A 在5 龄第6 天家蚕的前部、中部、后部丝腺中都有表达。前人利用RT-PCR 技术也分别探究了Abd-A 在5 龄第2 天和5 龄第3 天家蚕丝腺中的表达情况，对于家蚕日系二化性品种Kinshu×Showa，Abd-A 在5 龄第2 天的中部丝腺和后部丝腺中都有表达，而在前部丝腺中没有表达[25]；对于家蚕日系多化性N4 品种，Abd-A 在5 龄第3 天的前中部丝腺和后部丝腺中都有表达[26]。这与本研究的结果不尽相同，可能与其采用的家蚕品系、丝腺所处的发育阶段不同有关。由于丝腺各区段在不同发育阶段的生理状态不同，其基因时空表达模式也会有所差异。本研究中，BmAbd-A S、BmAbd-A 3编码区的第174—175位碱基均为AA，而BmAbd-A L（A59T）编码区的第174—175位碱基为GG。测序结果表明，该突变并非PCR 扩增引起的随机突变，推测这可能是同源染色体上等位基因间的碱基突变造成的序列差异。本研究采用家蚕D9L 品系对Abd-A 基因进行了鉴定，与前人采用家蚕N4 品系鉴定的Abd-A 基因序列有差异[25]，这可能与品种差异有关。需要指明的是，本研究从家蚕丝腺中克隆到Abd-A 的3 种剪接体，但不排除丝腺中还存在其他剪接体的可能性。

转录因子在分子结构上通常含有DNA 结合结构域、转录激活结构域、与配体结合结构域等[27]，能够协同其他因子对下游靶标基因的表达进行调控[5]。不同昆虫Abd-A 的多序列比对结果显示，Abd-A 编码的氨基酸序列都具有完全保守的DNA结合结构域Homeobox domain，这是Abd-A 作为Hox家族转录因子的特有结构域，它们可专一地调控生物形体的构建；而转录激活结构域Abd-A domain的羧基端序列在不同昆虫间存在较大差异，这可能与Abd-A 在不同昆虫中的生理功能差异有关。Abd-A 的3 种剪接体编码蛋白质的三维结构比对结果显示，它们的α 螺旋结构几乎重叠，其中包括Abd-A的必需结构域；而无规则卷曲结构差异较大。根据NCBI 数据库中已公布的Abd-A 序列，发现其广泛存在于多个物种中，昆虫来源居多。来自35种昆虫的Abd-A 氨基酸序列形成了3 个进化分支，膜翅目与鞘翅目聚为一支，双翅目、鳞翅目分别为独立的一支，基本符合物种的遗传进化规律。

Abd-A 的功能最早在果蝇中进行了研究，它界定在A4—A7 段，影响心脏的发育[28]。Abd-A 的表达受到长链非编码RNA 如iab-8 的调控，其表达下调会导致果蝇胚胎发育缺陷[29‐31]。Abd-A 在昆虫体节和胚胎发育中发挥重要作用，是害虫遗传控制的可能靶标[32‐35]。在家蚕中Abd-A 能够与转录因子POU-M2 相互作用，诱导家蚕蛹期的翅原基表皮蛋白基因的表达，促进家蚕从幼虫到蛹的转变[21，36]。另有研究表明，家蚕丝腺中丝蛋白基因的区域特异性表达受到几个包含同源结构域的转录因子的调控[37]，如Antp 和Awh 对丝蛋白基因的直接调控[25，38‐39]。Abd-A 与Antp 和Awh 都是属于Hox 家族编码的转录因子，且Abd-A 在丝腺中有表达，这也暗示转录因子Abd-A 也可能对家蚕丝腺中相关基因的表达具有调控作用。大肠杆菌原核表达系统由于能够在短时间内获得基因表达产物，成本较低，为应用最广泛的表达系统[40]。本研究选择大肠杆菌BL21（DE3）菌株进行原核表达，成功获得大量Abd-A 重组蛋白，这可为后续利用EMSA、Pull-Down 等方法研究Abd-A 的功能及其对丝腺中相关基因的表达调控奠定基础。

综上，本研究成功从家蚕丝腺中克隆到Abd-A的3 种剪接体，并利用生物信息学方法分析了其序列特征、空间结构和不同昆虫间Abd-A 的进化关系，通过原核表达获得了可溶性的重组蛋白，这为后期研究转录因子Abd-A 调控家蚕丝腺中某些相关基因的表达奠定了基础。