“果冻”药敏检测法筛选肾母细胞瘤个体化治疗方案的初步研究

张守华，苏凡优，何远桥，雷俊，项灯，曾俊权，曾金娣，谌卫龙，李匡凡，阎金龙

（1.江西省儿童医院普外科, 南昌 330006；2.南昌大学动物科学部, 南昌 330006；3.井冈山大学附属医院肿瘤科，吉安 343000；4.南昌大学第二附属医院肝胆外科，南昌 330006）

肾母细胞瘤是儿童一种最常见的肾脏肿瘤,其发病率占儿童恶性肿瘤的6%[1]。 手术+化疗的治疗方案在过去10 年间已经取得了非常显著的进展,但仍然有10%左右的患者预后较差。 其原因可能与部分患者对其化疗方案不敏感或者耐药有关[1-3]。因此，术后筛选以及对患者进行敏感、有效的个体化治疗方案已经成为目前研究的焦点。

由于肿瘤异质性的特点及其自身微环境的差异， 使得不同患者对相同的化疗方案的敏感性和效果具有显著的差异[4]。 因此，如何预测不同的个体肿瘤对化疗药物的敏感性， 有效地筛选并应用抗肿瘤药，成为目前迫切需要解决的问题。 本文应用“果冻”药敏检测法对肾母细胞瘤个体化治疗方法进行了初步研究[5]。

1 对象与方法

1.1 肿瘤样本 肿瘤样本均来自江西省儿童医院。经手术切除的肾母细胞瘤标本， 取样后快速装入含有组织保存液的50 mL 无菌离心管中， 在2 h内送至实验室， 样本运输装置内预先放入足够的冰块，在整个过程样本处在低温环境中。 肿瘤样本纳入标准：通过手术获取原位肿瘤组织标本，所纳入患者术后均需化疗。

1.2 材料及试剂 “果冻”药敏检测试剂盒（均购自南昌乐悠生物科技有限公司），MTT （均购自美国Sigma 公司），样本保存液、顺铂（齐鲁制药有限公司），伊立替康（江苏恒瑞医药股份有限公司），二甲基亚砜（DMSO）、环磷酰胺（江苏盛迪医药有限公司），紫杉醇（海口市制药厂有限公司），长春新碱（郑州恒峰药业有限公司），依托泊苷（江苏恒瑞医药股份有限公司），阿霉素（辉瑞制药（无锡）有限公司），奥沙利铂（江苏恒瑞医药股份有限公司）。

1.3 肿瘤样本处理 首先剔除坏死及无活性的组织，在生物安全柜内使用0.4% 的锥虫蓝染液检测肿瘤组织的活性，随后放入含量为0.2% 的碘伏溶液中浸泡，时间约30 s，然后用3% 双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗组织，并冲洗残留碘伏，最后将肿瘤组织分割成大约2 mm × 2 mm × 2 mm的组织块。

1.4 组织块接种 将“果冻”药敏检测试剂盒取出置于冰上，使其处于低温状态，每个孔内加入上述分割后的微组织块，加入含水凝胶的混合液，使其完全淹没微组织块，然后放入二氧化碳的细胞培养箱中孵育约2～3 h，待水凝胶完全凝固后，每孔加入100 μL 培养基，再次放入细胞培养箱中继续培养。

1.5 药物处理 在细胞培养箱中培养24 h 后，将96 孔板中的原培养基弃去， 对照组加入不含药物的完全培养基，药物组加入含有测试抗肿瘤药物的完全培养基；两组均每24 h 更换一次培养液。药物组和对照组所用的细胞培养基的成分完全相同。

1.6 敏感性检测 上述药物组在含有抗肿瘤药物的培养基中培养3～7 d 后， 弃去培养基， 用无菌PBS 洗涤3 次，再向孔中加入MTT 溶液，6 h 后将MTT 溶液弃去，将微组织块从水凝胶中取出，再放入新的细胞培养孔中， 然后加入200 μL 二甲基亚砜后震荡10 min， 从上述培养板中的每个孔中吸取100 μL 溶液加入新的96 孔细胞培养板的板孔中，使用酶标仪检测每孔的吸光度（OD）值。

1.7 结果分析 用酶标仪检测 在490 nm 波长处的OD 值。 各组药物抑制率=（1-药物组OD 值/对照组A 值）×100%， 其中根据MTT 比色法检测药物敏感性的判断标准为抑制率的30%， 抑制率小于30% 的药物可视为无效抗肿瘤药物。 实验重复3 次，取平均值。

2 结果

2.1 患者一般资料 本次共纳入四位患者， 其中1男3 女，平均年龄2.23 岁，均行肿瘤切除术，术前未化疗，术后病理诊断均为肾母细胞瘤，患者均需要接受化疗。

2.2 MTT 比色法结果及药物抑制率 微组织肿瘤块加入MTT 液6 h 后加入DMSO 呈现显色反应，组织活性越差其显色约浅， 反之肿瘤组织活性越好颜色越深（图1）。 经MTT 液显色后通过计算不同给药组的药物抑制率，临界值为30%，高于30%判定为有效，低于30%判定为无效。 四位患者肿瘤抑制率如下表1 所示。

表1 患者肿瘤抑制率

图1 MTT 比色法结果显示药物抑制率

3 讨论

相关研究证实肿瘤的异质性及不同肿瘤微环境的个体差异是影响肿瘤化疗敏感性的关键因素， 也是导致不同个体间对相同化疗方案的化疗效果存在差异的重要因素[6-7]。 尽管在大多数肿瘤治疗中存在不同的化疗方案， 但临床医师往往难以在多种化疗方案中选择患者敏感的方案， 从而导致治疗效果不确切，无法对患者进行精准治疗。目前常用的药物敏感性检测模型主要为永生化的细胞系模型及细胞系构建的肿瘤动物模型， 二者皆与患者肿瘤具体差异较大， 后者虽然能客观地反映患者肿瘤的异质性，但其耗时长且花费高。 本实验直接采用患者的肾母细胞瘤组织， 有效地克服了药物筛选中肿瘤的异质性与肿瘤微环境不一致的情况。 在传统细胞培养技术的基础上创新性地加入了水凝胶成分， 利用水凝胶提供的三维立体空间环境更好地保护了肾母细胞肿瘤微组织块的活性， 并保留了肿瘤的微环境， 此法被称之为“果冻”药敏检测法[8]。 通过“果冻”法进行化疗药物敏感性的筛选， 其结果更能准确地反映临床患者对不同化疗药物的反应。 值得注意的是，从肿瘤获取到药物敏感性检测结束的整个过程，操作简单、耗时较短，费用相对更低。

目前临床上肾母细胞瘤的化疗药物主要包括铂类、阿霉素、依托泊苷、环磷酰胺、长春新碱、伊立替康等[9-10]。 本研究中所用的药物方案主要是依据临床常用方案进行的选择。 虽然近年来肾母细胞瘤的化疗效果已经取得了显著进展， 但仍然有部分患者对化疗药物不敏感[1-3]。 在本研究中4 例患者在使用紫杉醇后的肿瘤抑制率分别为55%、48%、62%和84%， 表明紫杉醇具有显著的肿瘤抑制效果； 这可能是因为紫杉醇作为细胞周期抑制剂，能够同时抑制体内、外的肿瘤细胞[11]。顺铂的肿瘤抑制率也比较高， 其抑制率分别为36%、41%、24%及34%，但是顺铂很容易出现耐药性。 尽管在本次实验中患者对紫杉醇和顺铂敏感，但在用药选择上仍以临床方案为主，如出现耐药等情况，再考虑根据实验结果选择包含相应敏感药物的方案。 然而四例患者对环磷酰胺均未表现出敏感性， 这可能是由于环磷酰胺需要先在肝脏经酶转化成4-羟基环磷酰胺，再经过进一步的转化发挥抗肿瘤作用，单独在体外没有抗肿瘤活性[12]。也不排除是药物自身代谢途径的影响。 值得注意的是，四例患者对肾母细胞瘤最常用的药物长春新碱也未能表现出良好的反应。

本研究通过四例样本的筛选结果， 发现 “果冻”药敏检测法具有经济、快速且药敏结果与临床化疗方案疗效一致性较高的优势，但是“果冻”药敏检测法也具有如下不足之处：首先，本研究的样本量相对较少，尚缺乏足够的数据支撑研究结论；其次，作为一种体外的肿瘤药物筛选法，“果冻”药敏检测法对于需要进行体内代谢才能发挥肿瘤作用的药物如环磷酰胺评估欠佳。 最后，尚未将此药筛结果用于临床患者治疗， 其临床应用效果有待于进一步评估。 而且4 例肾母细胞瘤患者依据上述方法进行标准化疗方案的药物敏感性检测，其结果表现出极大的个体化和差异性。 本身即说明了化疗方案因“瘤”而异的必要性。 总之，这表明“果冻”药敏检测法用于肿瘤化疗药物筛选具有可行性依据，同时该方法简单、快速，用于肾母细胞瘤术后化疗药物的初步筛选具有很大的优势，在肾母细胞瘤个体化的治疗方案应用中具有潜在的应用价值。