白竭散对肛瘘术后急性感染性创面模型大鼠ICAM-1、TNF-α表达水平的影响*

孙晓健 赵梦月 王宏昌 毛细云

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.安徽省中西医结合医院，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031）

“肛瘘”中医学称为“肛漏”，即肛门周围皮肤与直肠在异常因素作用下相通的一种形态学改变，临床症状以肛周肿痛、溃破流脓及瘙痒为主，发病高峰在青壮年期，因饮酒、饮食、激素水平等因素影响，男性患者居多，约占80%［1］。肛瘘多由肛周脓肿急性发作期迁延发展而来，目前药物无法根治，手术仍是肛瘘治疗的不二选择［2］。中医认为湿热邪毒易攻下位，久蕴化腐成脓，漏道乃成，又因术创阻断了气血运行，肛门腠理失养，正虚邪恋，术后创面难愈［3］。临床诊疗中多种中药配伍而成的制剂对肛瘘术后创面愈合具有正性且独特的疗效。白竭散是我院特色药剂，本实验以肛瘘术后急性感染性创面模型大鼠为对象，观察白竭散对其创面愈合的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

64只雄性SPF级的SD大鼠，6周龄，体质量（200±20）g，于安徽医科大学实验动物中心购置，大鼠许可证号为SCXK（皖）2017-001。实验经安徽中医药大学动物伦理委员会批准。大鼠饲养于新安医学部国家重点实验室实验动物中心，饲养环境：温度20～25℃，湿度50%～70%，自由获取水和食物。

1.2 实验药物

白竭散（成分：白及、龙血竭，由安徽省中医院中药房制作并提供）。贝复济（外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子，广东珠海亿胜股份有限公司提供）。粪便混悬液：取健康人类大便50 g，与生理盐水1∶1均匀混合，无菌纱布过筛，2 000 r/min离心15 min，取上液备用。制作过程符合实验生物安全要求，试剂由安徽中医药大学新安医学部实验动物中心制作提供。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的ELISA试剂盒采购自BOSTER生物公司。

1.3 实验仪器

Peri Flux5000型激光多普勒血流仪（由深圳瑞沃德生命科技有限公司制造）；SK2000A型洗板机（由深圳盛信康科技有限公司制造）；Synergy H1型酶标仪（由美国伯顿仪器有限公司制造）等。

1.4 造模及分组

将宾东华［4］造肛瘘术后大鼠模型做适当改良，造急性感染性创面模型。术前于臀尾靠肛门部进行备皮处理，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠溶液3.5 mL/100 g进行麻醉，麻醉成功后用酒精棉球消毒备皮区域，并制作一个破坏皮肤全层直至肌层约0.2 cm且边长为1.5 cm的正方形创面。制作完备后分组，空白组大鼠创面滴加0.2 mL的生理盐水，用大小与创面相当的油纱辅料覆盖创面。剩余3组大鼠则是在各创面上加0.5 mL粪便混悬液，然后用与伤口大小相同的敷料覆盖固定（用4号手术线在伤口边缘进行对称缝合）。48 h后取下敷料并观察伤口，如果有脓性分泌物，则表示伤口已发生急性感染，模型复制取得成功。造模成功后，将每只大鼠进行单独饲养，防止发生大鼠之间相互撕咬，相互舔舐等影响到创面的意外情况。

1.5 治疗方法

空白组：每日早晚用生理盐水棉球清创后以无菌纱布覆盖固定（模拟我院患者早晚进行的大小两次换药），重复2周。白竭散组：每日早晚生理盐水棉球清创并用无菌干棉拭干，以布撒的方式将白竭散（1 g/cm2）均匀撒于创面，后用无菌纱布覆盖固定，重复2周。贝复济组：每日早晚生理盐水棉球清创并用无菌干棉球拭干，以贝复济150 Au/cm2均匀喷洒于创面，后予以无菌纱布覆盖固定，重复2周。模型组：每日早晚用生理盐水棉球清创并予以无菌纱布覆盖固定，重复2周。

1.6 指标观察

1.6.1 一般情况 观察并记录大鼠的进食饮水和活动状况以及创面情况（感染、水肿、渗液、质地、色泽、爬皮、肉芽生长等）。

1.6.2 创面愈合率 采用HVviewing8.0图像分析软件测定第3、7、10、14天共4个时间点大鼠伤口面积并计算创面愈合率，设治疗第1天的创面面积为基数（S），第n天创面愈合率=（S-第n天创面面积）/S×100%。

1.6.3 创面动态血流值 于第3、7、14天，3个时间点在每组大鼠的每个创面随机选取3个点，用动态血流仪测出每个点的血运情况，每个点记录30 s，最后采用图像分析软件进行分析，创面的动态血流值=3个点血流值的平均值。

1.6.4 创面ICAM-1、TNF-α水平 治疗第14天，检测大鼠创面动态血流量和愈合率并在数据收集完毕后颈椎脱位法处死大鼠。在无菌条件下取创面边缘至创面中心之间的新生肉芽组织块放入液氮罐中并置于-80℃冰箱保存。采用酶联免疫法检测，取出各组待测大鼠创面样本，预冷后PBS（0.01 mmol/L，pH=7.4）洗净样本组织后称重，再将其剪碎，后加入PBS（样本组织与PBS的重量体积比为1∶9）并用匀浆机进行冰上匀浆，匀浆液于4℃、12 000 r/min离心15 min，分离上清液后按ELISA检测试剂盒说明书进行检测，将酶标仪波长设定为450 nm，测出ICAM-1、TNF-α的OD值，绘出标准曲线得到直线回归方程式，将测得的OD值代入以上方程式并计算出目标蛋白的浓度。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较

大鼠模型复制完成后第1日，大鼠进食饮水及活动量较造模前明显减少。模型组、贝复济组、白竭散组创面情况较差，水肿明显，创面渗液较多，创面暗红且表面覆有脓性分泌物（色黄白）。空白组大鼠的情况稍好，仅因伤口疼痛出现进食饮水和活动量的降低。治疗后3 d，大鼠进食饮水与活动情况比治疗前稍改善，模型组大鼠伤口黑痂覆盖，创面组织水肿及渗液情况未见明显好转，白竭散组及贝复济组创面炎症比治疗前稍减轻。治疗后7 d，大鼠进食饮水与活动情况比治疗前有明显改善。模型组大鼠伤口黑痂覆盖，创面水肿发白，恢复情况较差，白竭散组和贝复济组大鼠创面炎症渗出较之前明显减少，炎症情况减轻，空白组大鼠创面无明显异常。空白组大鼠创面上皮爬行明显，贝复济、白竭散组大鼠创面边缘较多上皮爬行，恢复较好。治疗后14 d，除模型组外的3组大鼠基本情况均良好。模型组大鼠创面仍有部分的炎症，上皮爬行较其他组明显不佳；空白组大鼠创面进一步减小；贝复济组大鼠创面肉芽组织生长坚实良好，创面大部分已经上皮化，大部分白竭散组大鼠创面已接近愈合。

2.2 各组大鼠创面愈合率比较

见表1。治疗第7、10、14天，模型组大鼠创面愈合率明显低于空白组（P＜0.05），白竭散组与贝复济组大鼠创面愈合率均明显高于模型组（P＜0.05），贝复济组大鼠创面愈合率明显低于白竭散组大鼠（P＜0.05）。

表1 各组大鼠创面愈合率比较（%，±s）

表1 各组大鼠创面愈合率比较（%，±s）

注：与空白组同时间相比，*P＜0.05；与模型组同时间相比，#P＜0.05；与白竭散组同时间相比，△P＜0.05。下同。

组别空白组模型组白竭散组贝复济组n 16 16 16 16第3天10.12±2.93 9.98±3.01 10.13±3.01 10.25±3.45第7天45.26±4.53 34.12±6.13*63.98±5.79#55.33±5.36#△第10天61.44±5.96 46.33±4.55*△79.99±3.98#69.89±4.56#△第14天69.11±3.69 58.23±4.88*95.34±5.01#78.45±4.56#△

2.3 各组大鼠创面的血流值比较

见表2。治疗第3、7、14天，模型组大鼠创面血流值均明显低于空白组（P＜0.05），白竭散组与贝复济组的血流值均明显优于模型组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠创面血流值比较（mL/min，±s）

表2 各组大鼠创面血流值比较（mL/min，±s）

组别空白组模型组白竭散组贝复济组n 16 16 16 16第3天153.56±9.01 63.26±5.98*92.25±6.85#89.23±5.99#第7天156.12±8.56 75.69±8.03*112.56±8.36#110.45±8.12#第14天159.33±8.01 82.89±9.01*145.23±8.19#138.89±7.46#

2.4 各组大鼠创面组织中ICAM-1、TNF-α蛋白表达水平比较

见表3。白竭散组及贝复济组大鼠创面组织ICAM-1、TNF-α的表达量相较模型组均显著降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠创面组织ICAM-1、TNF-α蛋白表达水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠创面组织ICAM-1、TNF-α蛋白表达水平比较（pg/mL，±s）

组别空白组模型组白竭散组贝复济组n 16 16 16 16 ICAM-1 124.08±9.09 145.22±8.76 113.55±8.11#116.83±9.05#TNF-α 49.89±4.89 121.56±6.74 49.85±5.43#50.87±6.26#

3 讨论

肛瘘是肛门直肠周围的脓肿切开引流或溃破后的遗留病变，是肛管或直肠与肛周皮肤相通的一种病理性，肉芽性管道［5］。“瘘”相关记载首见于《山海经·中山经》，曰“仓文赤尾，食者不痛，可以为瘘”，《外科正宗》中阐述“肛漏”病因病机：膀胱经主湿热，肛痈溃破，邪毒未尽，湿热余毒集聚不散，机体淤积的湿热邪毒走行下位，疾病迁延发展，终成“肛漏”。治则如《外科理例》［6］中阐述“恶肉者，腐肉也。痈疽溃后，腐肉凝滞，必先去之，推陈致新之意”，因此，对于肛瘘的治疗当以手术疗法为主并辅以清热燥湿、解毒祛腐生肌等外用中药治疗［7］。“肛瘘切除术”属传统中医学中“金创”范畴，认为“利器所伤视为金创”［8］。在中医理论当中，首先人作为一个整体，因手术刀钳导致的筋肉经络的损伤，极易导致人体气机升降失调，局部气血津液运行中断，筋脉因气血阻滞无法通达，气血运行不达，肌肤、筋肉无以为养，其次外感邪毒或脏气失调，湿热之毒横生，走行下位，又因身体失恙，肝郁气滞，湿热淤积难以去除，久久不散，皮肤肌肉难以新生，津液久失，伤口经久难愈［9］。故在行肛瘘切除术后，仍要注重调节气血运行，祛除湿热余毒，祛腐敛创生肌。

毛细云教授根据“活血祛瘀定痛、生肌敛创止血”的原则配伍简方“白竭散”，方中白及性寒，味苦甘涩，归肺胃肝三经，《本草汇言》中介绍白及能够敛气化痰，止血除痈，同时能消肿散淤定痛，解毒祛腐生新［10］，《本草纲目》载其能够调节气血，生肌敛创［11］。龙血竭首载于《雷公炮炙论》，性甘辛咸，归肺脾肾三经，具有活血化瘀定痛、敛创止血生肌的作用［12］，《太平圣惠方》记载其为“活血化瘀之圣药”［13］。白及、龙血竭互为君臣，共奏调畅气血、消肿定痛、止血散瘀、去腐生新及敛创收口之效用。

白竭散以往的临床试验取得较多成果，李明月［14］研究发现，白竭散干预的30例肛瘘（低位单纯性）患者对比常规治疗的其他组肛瘘患者，观察的一系列宏观指标（肛门疼痛、肛门功能、术后疤痕评分）均具有显著性降低，且所测微观指标Ⅰ及Ⅲ型胶原蛋白表达较其他组患者有显著性提升，表明白竭散可以上调Ⅰ及Ⅲ型胶原蛋白表达水平，从而达到减少局部疤痕的形成，提升愈合质量。方笑丽等［15］研究发现，白竭散干预治疗的25例肛瘘患者，术后创面组织当中毛细血管的数量、VEGF以及第Ⅳ因子关联抗原较贝复济组和凡士林组具有显著性上调，表明白竭散可以提升局部创面血流供应，加速创面愈合，且可以上调以上生长因子来调节术后创面愈合。

现代研究发现，ICAM-1通过与毛细血管、微静脉和大血管内皮细胞上对应的特异性受体结合产生作用，直接损伤血管内皮［16］。TNF-α作为重要的促炎因子，能够促进多种炎症因子的释放，还能诱导白细胞对血管内皮细胞进行攻击杀伤，从而加重创面炎症反应［17］。庞素秋等［18］研究发现，白及提取物白及多糖对深Ⅱ度烧伤大鼠血清TNF-α的水平有明显抑制作用，进而促进创面愈合。林忆龙等［19］研究发现，龙血竭能通过降低中性粒细胞表达的白细胞分化抗原复合物含量来抑制ICAM-1的表达，缓解机体高炎性。ICAM-1、TNF-α在正常组织中表达水平较低，在肛瘘患者中，因应激性刺激导致ICAM-1、TNF-α的含量显著升高，表明了ICAM-1、TNF-α通过介导炎症反应减缓创面愈合，与患者肛瘘术后创面的水肿、渗液及疼痛等并发症有着密切的联系。

本实验结果显示，白竭散组大鼠创面水肿、渗液等较模型组、贝复济组有明显改善，创面愈合率、血流值较模型组明显提高，且第7、10、14日，白竭散组创面愈合率显著高于贝复济组，干预14 d后，白竭散组的ICAM-1、TNF-α含量较模型组显著降低。结果表明白竭散可以有效改善肛瘘术后创面水肿、渗液等并发症，改善创面血运、加速创面愈合，并通过降低ICAM-1、TNF-α的含量来减轻炎症反应。