高效液相色谱法测定山梨酸、苯甲酸含量

字琴江，杨 冲，王 瑾，左李美，赵 芳，罗桂槐

（1.洱源县检验检测院，云南洱源 671200；2.云南农业职业技术学院，云南昆明650031；3.昆明市城市排水监测站，云南昆明 650118）

近年来，随着食品工业的快速发展，食品添加剂已被广泛应用于食品加工、储存中，防腐剂能抑制微生物繁殖，延长食品的保质期，防止食物变质、腐败，防腐剂的出现给人们生活带来极大便利[1]。苯甲酸和山梨酸是人工合成防腐剂中造价最便宜、性能最稳定、毒性最低的，因此被广泛使用。但过量使用防腐剂会对人体健康造成一定影响。例如，山梨酸会改变细胞壁、细胞膜的渗透压，使生物体内的代谢物逸出细胞导致其失活[2]。苯甲酸会对细胞原生质部分遗传物质产生效益，长期使用可能诱发哮喘、荨麻疹等过敏反应[3]。各国对食品中添加山梨酸、苯甲酸的量都有严格的要求，均制定了限量标准，不允许超限量使用。因此，建立一种山梨酸、苯甲酸快速、灵敏、高效及适用范围广的检测方法非常 重要。

为了准确测定山梨酸、苯甲酸的含量，科研工作者研发了很多定量分析方法，并将其应用于山梨酸、苯甲酸的检测。例如，毛细管电泳法[4]、紫外分光光度法[5-6]、气相色谱法[7]、高效液相色谱法[8-10]及离子色谱法[11]等，其中高效液相色谱法具有选择性高、分离效能高、检测灵敏度高以及分析速度快等优点，在食品分析领域被广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自制橙汁（样品来自于云南省市场监督管理局2021年能力验证考核样）。甲醇（色谱纯），美国赛默菲飞世尔科技公司；食品防腐剂山梨酸溶液标准物质（1000 mg/L），食品防腐剂苯甲酸溶液标准物质 （1000 mg/L），中国计量科学研究院；实验所用的其他试剂均为分析纯，实验室所用水均为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（LC-2040C 3D），配二极管检测器，岛津仪器有限公司；离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司；分析天平，岛津仪器有限公司；涡旋振荡器，常州华奥仪器制造有限公司；超声波发生器，上海科导超声仪器有限公司。

1.3 操作方法

1.3.1 标准溶液的配制

将苯甲酸、山梨酸分别配制为浓度0.5 mg/L、 1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0 mg/L及20.0 mg/L的混合标准系列工作溶液，现配现用。

1.3.2 样品前处理

准确称取橙汁约2.0 g（精确到0.0001 g）试样于50 mL具塞离心管中，加水约25 mL，混匀，超声20 min（水温50 ℃），冷却至室温，离心5 min（转速6000 r/min），将水相转移至容量瓶中，残渣中加入20 mL纯净水，混匀后继续超声5 min，离心5 min（转速6000 r/min），将水相转移到同一容量瓶中，定容至刻度，混匀，取上清液过0.22 μm滤膜，放入进样品中，待液相色谱仪测定。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 mm， 3.5 μm）；流动相：乙酸铵溶液∶甲醇=95∶5；流速：1 mL/min；柱温恒温：30 ℃；检测器：二极管；进样量：10 μL。

2 结果与分析

2.1 检测结果

在最佳实验条件下，对山梨酸、苯甲酸进行检测，随着苯甲酸、山梨酸浓度进一步增加，在230 nm处的特征吸收峰逐渐增强，苯甲酸的标准曲线方程为Y=33750.5X-5639.2，山梨酸的标准曲线方程为Y=63772.0X-9682.0，r均为0.9996，表明山梨酸、苯甲酸标准浓度在0.5～20.0 mg/L与响应强度的线性关系良好。苯甲酸的标准曲线和山梨酸的标准曲线分别如图1和图2所示。

图1 苯甲酸的标准曲线

图2 山梨酸的标准曲线

2.2 回收率和精密度试验

在样品中进行方法准确度验证，在橙汁中添加苯甲酸和山梨酸标准溶液，进行加标回收试验验证。取2.0 g（精确至0.0001 g）橙汁3份，分别在A1～A3样品中加入浓度为100 mg/L的苯甲酸和山梨酸标准溶液500 μL，B1～B3样品中加入浓度为 100 mg/L的苯甲酸和山梨酸标准溶液1.0 mL，定容成 50.0 mL，结果如表1所示。从表1中可以看出，苯甲酸加标回收率在94.15%～95.90%，山梨酸加标回收率在93.60%～94.40%，符合加标回收率的标准要求。

表1 样品中苯甲酸、山梨酸检测回收率

选择苯甲酸、山梨酸的标准溶液进行方法精密度实验，将3.0 mg/L混合标准溶液在最佳的色谱条件连续重复进样14次，对比色谱图并记录各防腐剂的保留时间、峰面积以及峰高的RSD，结果如表2所示。保留时间、峰面积以及峰高的相对偏差分别小于1.96 %、1.61%、1.89%，结果显示RSD均小于1.96%，说明该方法以及仪器条件均满足苯甲酸、山梨酸的检测。

表2 方法的重复性试验（n=14）

3 结论

本文对橙汁中苯甲酸、山梨酸的含量进行测定，前处理方法简单，简便易操作，在0.5～20 mg/L呈良好的线性关系，相关系数为0.9996，苯甲酸加标回收率在94.15%～95.90%，山梨酸加标回收率在93.60%～94.40%，RSD在0.97%～1.96%，检测结果均符合标准要求。结果显示该方法测定山梨酸、苯甲酸含量准确有效，可广泛被用于食品中苯甲酸、山梨酸的检测。