一种山梨酸钾快速检测试剂盒的研究

张 岐，安斌芳，王立霞，郑雨桐，王 佳，郭晓晴

（吉林省北华大学医学技术学院，吉林吉林 132013）

山梨酸钾，又名2,4-己二烯酸钾，是山梨酸的钾盐，分子式为C6H7O2K，白色至浅黄色鳞片状结晶、晶体颗粒或晶体粉末，无臭或微有臭味，长期暴露在空气中易吸潮、被氧化分解而变色，易溶于水，溶于丙二醇和乙醇[1-2]。其常被用作防腐剂，通过与微生物酶系统的巯基结合从而破坏许多酶系统，毒性远低于其他防腐剂。山梨酸钾含量一旦超标且长期被人们食用，会对人体产生伤害，在一定程度上抑制骨骼生长，以及损伤肝和肾[3]。因此，在食品卫生检验等方面，山梨酸钾含量的检测具有极其重要的意义[4]。本文研制了乳酸菌中山梨酸钾的检测试剂盒，并研究了其制作工艺、最低检测限、保存条件及时间等，该试剂盒具有快速检测、反应灵敏、携带方便及成本低廉等特点，具有广泛的应用价值和市场开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山梨酸钾、2-硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric Acid，TBA）、氢氧化钠（粒状）、盐酸、硫酸均为国产分析纯；30%双氧水；普通慢速定性滤纸、乙酸纤维素膜（Q/HSG 1-93）、硝酸纤维素膜（Startorius CN140）；PVC胶板（DB-8）、聚酯纤维素膜（MA0800）、玻璃纤维素膜（GL-b 01）、吸水垫（GRADE 270）、塑料卡（A-8）和衔接胶带：市售。“畅益星”乳酸菌风味饮料：市售。

1.2 仪器与设备

隔水式电热恒温培养箱（PYX-DHS-50X65-B-Ⅱ）；电子天平（沈阳龙腾有限公司）；往复式水浴恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；3个250 mL烧杯；一个50 mL容量瓶；一个100 mL容量瓶；胶头滴管；玻璃棒；250 mL量筒；50 mL容量瓶；多个试管；3个空平板（15 cm）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理

利用山梨酸钾与双氧水-硫酸溶液氧化后形成丙二醛，然后丙二醛与硫代巴比妥酸（TBA）生成红色化合物三川甲，通过显色的深浅与山梨酸钾的含量在一定范围内成正比为理论基础，化学反应式 如下：

1.3.2 山梨酸钾溶液的配制

称取干燥的山梨酸钾粉末0.250 g，加入蒸馏水50 mL，用50 mL容量瓶定容，配制出5.0 g/L的山梨酸钾标准液。然后将标准液稀释成6个等级的浓度梯度，配制成山梨酸钾应用液，浓度分别为5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L的山梨酸钾水溶液。

1.3.3 乳酸菌中山梨酸钾浓度梯度的配制

称取干燥的山梨酸钾粉末0.125 g、0.250 g、 0.375 g、0.500 g和0.625 g分别加入6个5 mL乳酸菌饮料中，制备浓度分别为6.0 g/L、5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L和1.0 g/L的溶液。

1.3.4 显色剂浓度的确定

称取干燥的硫代巴比妥酸粉末4.00 g，用250 mL 容量瓶定容，配制出16.0 g/L的硫代巴比妥酸标准液，然后用标准液稀释成4.0 g/L、8.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液。不同浓度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、 1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸钾溶液氧化之后分别加入4.0 g/L、8.0 g/L、16.0 g/L的硫代巴比妥酸溶液进行显色反应，确定显色反应的最佳显色剂浓度。

1.3.5 试纸条的制备及纸型筛选

选择普通慢速定性滤纸、乙酸纤维素膜、硝酸纤维素膜，将其裁剪成边长为8 cm正方形，用16.0 g/L 硫代巴比妥酸中浸泡5～10 min，立即用镊子取出置于恒温箱（37 ℃）中干燥30 min，干燥结束后，观察经过硫代巴比妥酸浸泡的试纸条是否有变形和变色现象。若试纸条无变形和变色现象，将试纸的四边统一裁剪成3 cm×0.5 cm规格的长条，储存于避光、干燥、密闭处，备用。实验时，将试纸条整齐地放置于平板上。然后滴加经1% H2O2氧化后的不同浓度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和 0.2 g/L）的山梨酸钾溶液。观察试纸的显色情况，从显色速度、显色效果判断显色是否稳定。

1.3.6 灵敏度检测

用16 g/L的硫代巴比妥酸浸泡试纸条，然后分别与氧化之后的不同浓度（5.0 g/L、4.0 g/L、3.0 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L和0.2 g/L）的山梨酸钾溶液进行显色实验，得出最低的显色浓度。

1.3.7 试纸条的保质期

将部分试纸条装入用黑色塑料袋密封的试管中，用橡胶塞塞紧放入冰箱（4 ℃），即模拟低温、避光、隔氧的保存环境。部分不进行任何处理，放置于抽屉中，即室温、普通避光、干燥环境。每隔2 d取出几片进行检测限和中等山梨酸钾浓度的显色实验。实验在上午或下午固定时间进行，尽量在相同光照强度下记录和拍照。

2 结果与分析

2.1 显色剂浓度的确定

随着山梨酸钾和TBA溶液浓度的增加，显色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的试纸显色效果最好，具体见图1和表1。

表1 不同TBA浓度时水的显色结果

图1 不同浓度山梨酸钾溶液 在不同浓度TBA溶液试纸的显色结果

2.2 试纸条的制备及筛选

试纸条是影响实验结果的主要因素，其选择需要满足易吸附试剂且吸附量较大、干燥时间短、显色速度快和颜色变化明显等要求。本实验分别选用3种常见类型的试纸条，观察显色效果，确定最佳试纸条。经过实验发现，3种试纸条，普通定性滤纸吸药量少，显色效果差；乙酸纤维素膜虽吸药量较多，但显色结果一般。只有硝酸纤维素膜的吸药量大，吸药均匀，浸药干燥后形状没有变化，手感也无明显的改变，可确定为最佳纸型。显色结果表明，该类型试纸条显色均匀，显色速度快且颜色持续时间久，显色后纸的变形程度小，适合做成产品（表2）。因此，选择硝酸纤维素膜在乳酸菌中进行显色 实验。

表2 试纸条的吸药量、显色效果的实验结果

2.3 灵敏度检测结果

随着山梨酸钾浓度的增加，显色逐步加深。用16.0 g/L TBA溶液制作的试纸显色效果最好，本试纸条的检测范围大于1.0 g/L，最低检出限是1.0 g/L （图1）。

用试纸法分别检测乳酸菌中不同浓度梯度的山梨酸钾溶液，结果表明，当山梨酸钾溶液的浓度低于1.0 g/L时，肉眼无法辨别试纸的颜色变化。随着山梨酸钾浓度增加，试纸显色加深，当山梨酸钾溶液浓度达到3.0 g/L时，试纸显色为深棕色。因此，试纸的最低限度1.0 g/L（图2），此浓度等于乳酸菌中出现的山梨酸钾浓度（1.0 g/L）[5]。

图2 乳酸菌中不同浓度山梨酸钾显色结果

2.4 试纸条的保质期

由表3可知，4 ℃避光保存条件下，40 d后部分试纸条开始发生颜色变化。室温避光条件下（18～27 ℃，抽屉中），30 d后试纸条变红。试纸条在低温和室温保存效果有明显差别，低温保存时间较长，效果较好，保存过程中注意避光。

表3 不同条件下试纸条保存后颜色变化

2.5 试纸盒的组装

以硝酸纤维素膜（NC膜）为显色区，玻璃纤维素膜为样品垫（滴加检测物：山梨酸钾），聚酯纤维素膜为显色剂垫（浸泡干燥后的TBA试纸），PVC胶板为底座，吸水垫为吸水滤纸加速样品的流动，见图3和图4。

图3 试剂盒模型

图4 试剂盒

3 结论

本实验建立了一种快速检测山梨酸钾浓度的试纸条法，对其制备工艺条件及配方进行了优化，结果表明，采用硝酸纤维素膜、质量浓度为16.0 g/L 的TBA溶液、浸泡时间5～10 min、干燥温度37 ℃， 制备的试纸具有良好的性能。试纸法检测山梨酸钾仅需5～10 min，检测灵敏度为1 g/L，具有样品量小、反应灵敏、成本低廉、使用方便和操作简单的优点。与传统的山梨酸钾实验检测方法相比，实现了现场快速检测，其检测范围较大，应用领域广泛，是一种快速半定量检测方法，在食品、发酵、医学和药学等产业中有良好的发展 前景。