兽用原料药博普总碱的HPLC特征谱图的建立

陈燕乐，唐昭山，2，杨广民，曾建国

(1.湖南美可达生物资源股份有限公司，长沙 410331；2.湖南省中药提取工程研究中心，长沙410329；3.湖南农业大学湖南省中兽药重点实验室，长沙410128；4.湖南省兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，长沙410128)

罂粟科博落回属的博落回(Macleayacordata(Willd.)R.Br.)是一种多年生直立草本植物。湖南美可达生物资源股份有限公司专业从事博落回药用植物的种植、生产、销售以及相关的研究工作。博落回植株中富含生物碱，在各个部位中果实含量最高[1]，是主要的生产原料。生物碱中主要包括血根碱，白屈菜红碱，原阿片碱，别隐品碱[2-3]，另外还含有微量的二氢白屈菜红碱等生物碱等[4]。美可达公司经过多年的生产实践，不断的优化和研究，对博落回药用植物资源进行全面开发。博落回果提取苯并菲啶类生物碱后产生的废弃的滤残液和残渣中，有着大量的普托类生物碱，具有显著的抗炎活性，公司将包含普托类生物碱的滤残液部分开发成治疗大肠杆菌性腹泻的博普总碱国家二类新兽药[5]。本实验拟对该兽药进行特征谱图研究，用对照品定性鉴别博普总碱的特征峰，并对特征峰的相对保留时间进行规定，建立简便快速的方法，为全面控制博普总碱原料药的质量提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津20A型高效液相色谱仪(SPD-20A检测器和LC solution B.1.24色谱工作站)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(梅托勒-托利仪器(上海)有限公司)。

1.2 材料 原阿片碱(批号：110853-201003，纯度：99.9%，中国药品生物制品检定所)；别隐品碱(批号：17101504，纯度：99.9%，湖南美可达生物资源股份有限公司自制)；盐酸血根碱(批号：510001-201101，纯度：99.3%，中国药品生物制品检定所)；白屈菜红碱(批号：111718-201402，纯度：80.5%，中国药品生物制品检定所)；博普总碱原料药(湖南美可达生物资源股份有限公司生产)；乙腈为色谱纯；水为纯化水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 取对照品原阿片碱、别隐品碱、盐酸血根碱和白屈菜红碱适量，精密称定，加甲醇-1.0%盐酸(50∶50)100 mL溶解，制成每1 mL含原阿片碱0.095 mg、别隐品碱0.049 mg、盐酸血根碱0.021 mg、白屈菜红碱0.012 mg的溶液即得。

2.2 供试品溶液的制备 取博普总碱粉末约20 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-1.0%盐酸水(50∶50)50 mL，称定重量，超声(功率250 W，33 KHz)处理30 min，取出，放冷，称定重量，用甲醇-1.0%盐酸水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 根据公司博落回系列产品的内部高效液相分析方法及相关的文献报道[6～8]，确定的高效液相色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优化使用Agilent TC柱(250×4.6 mm，5 μm))；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0～14 min，25% A；14～27 min，25%～60% A；27～29 min，60%～25% A；29～35 min，25% A；流速为0.8 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为287 nm。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

2.4 检测波长的选择 液相特征图谱中呈现的4个特征峰分别为原阿片碱峰、别隐品碱峰、盐酸血根碱峰和白屈菜红碱峰，使用全波长扫描发现4个成份在270～290 nm波长范围内均有较好吸收，这4个成份的紫外最大吸收波长分别为289、285、274 及269 nm，因为博普总碱中原阿片碱和别隐品碱峰为主要成份，故其检测波长确定为287 nm。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 取同一份供试品溶液，按照上述色谱条件进行下连续进样6次，每次5 μL。供试品特征图谱中应有4个特征峰，以原阿片碱参照物峰为S峰，计算特征峰2、特征峰3、特征峰4的相对保留时间，如表1所示，结果表明该方法的仪器精密度良好。

表1 精密度考察结果

2.5.2 稳定性考察 取同一份供试品溶液，按照上述色谱条件进行下分别于0、4、8、12、18、24 h进样，供试品特征图谱中应有4个特征峰，以原阿片碱参照物峰为S峰，计算特征峰2、特征峰3、特征峰4的相对保留时间，如表2所示，表明供试品溶液在24 h内稳定。

表2 稳定性考察结果

2.5.3 重复性考察 取同一批次样品制备供试品溶液，按照上述色谱条件进行下平行进样6份，结果见表3。试验结果表明，供试品的重复性良好。

表3 重复性考察结果

2.6 博普总碱特征图谱的建立及相关数值的规定

2.6.1 特征图谱的建立和特征峰的定性鉴别 取15个不同批次的博普总碱原料药，批号分别为100701、100702、100703、110901、110902、110903、140501、140502、140503、180401、180402、180403、200501、200502及200503，按已确定的色谱条件进行测定，记录色谱图，以半峰宽为20，斜率为1000，最小峰高为最高峰的1.5%进行积分。将所有批次样品色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以S1(100702)样品色谱图为参照图谱，时间窗宽度0.10S，进行多点校正，得到15批样品叠加图，并建立博普总碱特征图谱的对照图谱，详见图1和图2，各批次样品的相似度结果均大于0.95。

图1 15个批次博普总碱原料药的特征图谱

峰1：原阿片碱 峰2：别隐品碱 峰3：血根碱 峰4：白屈菜红碱

将含有原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱的混合对照品溶液，以及博普总碱供试品溶液按已确定的色谱条件测定，记录色谱图，见图3。

A：博普总碱混合对照 B：博普总碱供试品

2.6.2 特征图谱内容的规定 按上述的色谱条件测定，记录15个不同批次博普总碱原料药各特征峰的保留时间，计算各特征峰和参照物峰S的相对保留时间(表4)，所有特征峰的相对保留时间RSD均小于5%。故应规定各供试品溶液的色谱图中应有4个特征峰，其原阿片碱峰为S峰，计算特征峰2、峰3和峰4与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为：1.19±0.06(峰2)，1.92±0.10(峰3)，2.41±0.12(峰4)。

表4 样品测定结果

3 讨论与结论

3.1 流动相的优化 采用4个不同液相流动相系统对博普总碱原料药进行洗脱：(Ⅰ)甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)；(Ⅱ)甲醇(A)-0.2%三乙胺-0.1%磷酸水(B)；(Ⅲ)乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)；(Ⅳ)乙腈(A)-0.2%三乙胺(磷酸调pH=2.5)(B)。

其中流动相系统Ⅲ和Ⅳ，效果较好，即乙腈水系统分离洗脱效果比甲醇水系统好；其中三乙胺磷酸属于缓冲盐，对液相设备损害较大，操作较为复杂，最终选择流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)。

3.2 检测波长对相对保留时间的影响 使用同一供试品溶液，选择不同检测波长282、285、287、289和292 nm进行检测，并计算相对保留时间，结果显示各特征峰的相对保留时间RSD均小于1%，故检测波长对特征峰的相对保留时间影响很小。

3.3 柱温对相对保留时间的影响 使用同一供试品溶液，选择不同柱温25、30、35、40 ℃进行检测，并计算相对保留时间，结果显示特征峰2和特征峰3的相对保留时间RSD均小于5%，但特征峰4相对保留时间RSD为5.41%。可见不同柱温对特征峰的相对保留时间影响较大，尤其是特征峰4(白屈菜红碱峰)。

3.4 流动相流速对相对保留时间的影响 使用同一供试品溶液，选择不同流速0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min进行检测，并计算相对保留时间，结果显示特征峰2和特征峰3的相对保留时间RSD均小于5%，但特征峰4相对保留时间RSD为8.48%。可见不同流速对特征峰的相对保留时间影响较大，尤其是特征峰4(白屈菜红碱峰)。

3.5 不同品牌色谱柱对高效液相特征谱图的影响 使用同一供试品溶液，选择不同品牌C18(250×4.6 mm，5 μm)液相色谱柱Xunion、Welch Ultimate、ACE Excel、Agilent HC和Agilent TC，进行检测，并计算相对保留时间，结果显示除了特征峰2相对保留时间RSD小于5%外，特征峰3的相对保留时间RSD为8.79%，特征峰4的相对保留时间RSD为11.80%，故不同品牌色谱柱对特征峰的相对保留时间影响较大，最好固定色谱柱品牌进行使用，考虑市场上销售量较大和使用效果，优化使用Agilent C18系列色谱柱，尤其使用Agilent TC柱。

本研究对原料药博普总碱有效部位进行了特征图谱研究，可在含量测定的同时，进行特征图谱的测定，相较于博落回生物碱的薄层鉴别[3]更为快速和方便。同时，应用特征图谱技术指认了4个特征峰并规定了相对保留时间。该方法具有良好的精密性、溶液稳定性和样品重复性，为全面控制博普总碱的质量提供了依据。