大花独蒜兰提取物对植物病原真菌的抑菌活性

黄达龙

(福建省南安市林业科技推广站， 福建南安 362300)

大花独蒜兰(Pleione grandiflora)是兰科(Orchidaceae)独蒜兰属(Pleione)多年生草本植物，自然分布中心为中国云南(Chenet al，2009)。 独蒜兰属兼具观赏和药用价值，中国药典记录独蒜兰(P. bulbocodioides)和云南独蒜兰(P. yunnanensis)干燥的假鳞茎入药具有清热解毒，化痰散结的功效(国家药典委员会，2015)。 原产于中国西南部的独蒜兰属植物，早在20 世纪初就被引种到西方植物园(Cribbet al，1999)。 在欧洲、日本等地及中国台湾均有广泛栽培应用，是具有经济与生态价值的重要植物资源(沈立明等，2021；吴沙沙等，2020)。 目前，关于独蒜兰属的研究报道主要集中在观赏和药用领域，其抗病原菌活性鲜有报道。

炭疽病是农业生产中的常见病害，由炭疽病菌感染寄主植物的靶细胞引起的(沈量等，2020；Chudasamaet al，2021)。 染病作物叶片及果实上形成圆形病斑，严重影响作物产量和品质(Sharmaet al，2017)。 目前对作物炭疽病的防治仍以化学手段为主(贤小勇等，2021)，但传统的化学防治手段易造成环境污染、病原菌产生耐药性等问题。 因此，环境友好型的植物源杀菌剂成为近年来新型农药研发的热点(于忻滢等，2021；Huanget al，2010)。

本研究拟采用菌丝生长速率法测定大花独蒜兰假鳞茎提取物对11 种常见植物病原真菌的抑制活性，旨在筛选出高效的抑制菌种，为新型植物源杀菌剂的研究提供依据，为其种质资源的进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大花独蒜兰假鳞茎采集于云南省怒江傈僳族自治州，保存于福建农林大学兰科植物保护与利用国家林业与草原局重点实验室。

11 种植物病原真菌菌种由福建农林大学生物农药与化学生物学重点实验室提供(表1)。

表1 供试植物病原真菌Table 1 Plant pathogens investigated in this study

用去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水定容至1 000 mL，配制PDA 培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 大花独蒜兰假鳞茎提取 取大花独蒜兰假鳞茎切碎，于50 ℃烘干，将干燥后的样品经粉碎机粉碎至粉末状，共得样品7 kg。 将粉末过40 mm 筛，用75%甲醇于80 ℃水浴锅中进行冷凝回流，料液比按照第一次1 ∶8、第二次1 ∶6 各回流2 次，每次2 h，过滤且合并2 次滤液，减压浓缩得浸膏共2.45 kg，得率35%。

将浸膏溶于24 L 纯水，选用大孔吸附树脂D101(预先用92%乙醇活化处理)洗脱，洗脱溶剂和洗脱体积分别为蒸馏水11 BV(BV 为柱体积，1 BV＝9 L)、30%乙醇3 BV、60%乙醇3 BV、90%乙醇1 BV，收集各自的流份，减压浓缩得各组分浸膏。 本试验取活性试验成分相对富集的中等极性组分，60%乙醇部位浸膏。 用2 mL 色谱甲醇溶解200 mg 的浸膏，配制成浓度为100 mg·mL-1的 2 mL 供试样品。

1.2.2 大花独蒜兰提取物对11 种植物病原真菌的抑菌活性分析 采用菌丝生长速率法(刘星星等， 2019)，挑取培养5 d 菌落边缘的菌丝块(直径 5 mm)，转接至含浓度为2 mg·mL-1大花独蒜兰假鳞茎提取物的PDA 培养基中央。 并以空白PDA 培养基作为对照，每个处理重复3次。 于(28±5) ℃条件下培养，每24 h 观察一次。 采用十字交叉法，分别测量并记录各组菌落生长直径，不规则菌落取其最大值。 计算方式如下。

1.2.3 大花独蒜兰提取物对植物病原真菌的毒力测定 经初筛，得到抑制效果明显的供试菌。 进一步探究供试样品对这些供试菌的致死中浓度EC50。 根据所得数据，以提取物浓度为横坐标，通过生物统计机率值换算，以抑制率对应的几率值作为纵坐标，利用origin 软件得出回归方程和相关系数r，抑制率为50%时，计算EC50值。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性研究

结果表明，在大花独蒜兰假鳞茎提取物浓度为2 mg·mL-1的条件下，对11 种植物病原菌均有不同程度的抑制作用，尤其对白菜炭疽病菌、芭乐炭疽病菌、链孢粘帚霉病菌的抑制作用 强， 抑 制 率 分 别 达 100.00%、93.88%、60.51%(图 1)。 故选取上述3 种供试菌，进一步测定大花独蒜兰提取物对其毒力回归方程及致死中浓度EC50。

图1 大花独蒜兰提取物对11 种真菌的抑菌活性Figure 1 Anti-phytopathogenic activity of Pleione grandiflora extracts against eleven plant fungi

2.2 不同浓度的大花独蒜兰提取物对3 种植物病原真菌的抑制率

选取3 种抑制效果明显的供试菌，分别测定不同浓度的大花独蒜兰提取物对这些病原真菌的抑制率(图2)。 结果显示，0.05、0.10、0.20 mg·mL-1大花独蒜兰提取物对白菜炭疽病菌的抑制率分别为10.19%、29.30%、66.88%。 0.50、1.00、2.00 mg·mL-1大花独蒜兰提取物对芭乐炭疽病菌的抑制率分别为12.43%、49.7%、93.88%。 1.00、1.50、2.00 mg·mL-1大花独蒜兰提取物对链孢粘帚霉病菌的抑制率分别为29.14%、46.36%、60.93%。

图2 大花独蒜兰提取物对3 种真菌的抑制率Figure 2 Inhibition rates of Pleione grandiflora extracts against three plant fungi

2.3 3 种植物病原真菌的致死中浓度测定

根据表2，采用最小二乘法计算，大花独蒜兰提取物对白菜炭疽病菌毒力方程为y＝7.377 0＋2.836 2lgx(r＝0.996 3)，当抑制率为 50%时，EC50＝0.145 2 mg·mL-1。 对芭乐炭疽病菌毒力方程为y＝5.127 9＋4.487 7lgx(r＝0.995 6)，当抑制率为 50%时，EC50＝0.936 5 mg·mL-1。 对链孢粘帚霉病菌毒力方程为y＝4.443 0＋2.739 3lgx(r＝0.999 5)，当抑制率为50%时，EC50＝1.597 0 mg·mL-1。

表2 大花独蒜兰提取物对3 种真菌的毒力测定Table 2 Virulence of Pleione grandiflora extracts against three plant fungi

3 结论与讨论

本试验通过测定大花独蒜兰假鳞茎乙醇提取物对11 种植物病原真菌的抑菌活性。 试验结果表明该提取物对白菜炭疽菌、芭乐炭疽病菌、链孢粘帚霉病菌具有显著的抑制作用，且抑制活性优于目前大量使用的环境友好型植物源农药乙蒜素(吴沙沙et al，2021)。 结合回归分析数据，大花独蒜兰提取物对白菜炭疽病菌的抑菌活性最好，EC50值为0.145 2 mg·mL-1，可作为一种新型植物源农药进一步研究，同时对大花独蒜兰野生种植资源的科学利用有一定参考价值。