结核分枝杆菌耐药性检测方法的研究进展

奚少勇，磨立达

〔南宁市第四人民医院，广西艾滋病临床治疗中心（南宁）检验科，广西 南宁 530023〕

结核病是全球范围内重要的传染病。耐药结核病的出现给结核病的防治带来了严峻的挑战。世界卫生组织（WHO）于2013 年重新修订了耐药结核病的分类（主要分为以下五类：单耐药结核病、多耐药结核病、耐多药结核病、广泛耐药结核病和利福平耐药结核病）[1]。2020 年，WHO就全球结核病(TB) 进行统计，数据显示，2019 年全球新增结核病患者996 万例，约有3.3% 的新患者和18% 的复治患者对RFP 耐药，估算利福平耐药结核病患者数约有46.5 万，其中耐多药结核病患者约占78%。我国的耐药结核病（DR-TB）患者数约为6.5 万，占全球的14%，相关疾控形势相当严峻[2]。我国每年花费大量的资金用于治疗DR-TB，但效果不够理想，患者的死亡率较高（死亡病例数几乎是全球结核病死亡病例数的四分之一），近年来不少菌株对贝达喹啉（Bbq）、德拉马尼（Dlm）等新药逐渐发生耐药，甚至达到了无药可用的地步[3]。耐药结核病的诊断主要以MTB DST 检测结果为依据。在本文中，笔者主要是对各种MTB DST 检测方法的研究进展进行综述。

1 表型DST 检测方法

当前，业内一致认同MTB 耐药性检测必须依赖于MTB 培养。MTB 培养主要是利用绝对浓度法或比例法将菌株接种于含抗结核药及不含药的罗氏培养基上，根据培养基表面覆盖菌落数量或无菌落情况判断培养菌株是否产生耐药性。另外，也可利用菌株在含药和不含药液体培养基中的生长情况来判断其是否产生耐药性。此方法可同时检测其对多种药物的耐药性，包括一线及二线抗结核药。然而，检测表型DST 需使用MTB 纯培养物，且MTB 存在生长较慢、有生物安全危害性的特性，这决定了该检测方法存在费时、成本高、可比性差等缺点[4]。另外, 在培养异质性耐药菌株时，敏感菌比耐药菌生长快，这可能会引起耐药漏判。

1.1 传统的表型DST 检测方法

目前临床上常用的表型DST 检测方法主要包括绝对浓度法和比例法，用这两种方法检测MTB耐药性的相符性均达80% 以上，检测RFP 耐药性的相符性可高达90%。研究表明，在对MTB耐药的检出率方面，比例法优于绝对浓度法。上述传统DST 检测方法的优势是可同时检测十几种抗结核药物的耐药水平、有商业化的试剂、操作简便、检测费用低，适于在县级疾控中心或县级定点医院开展。但其同时存在较多缺点，包括检测EMB、吡嗪酰胺(PZA)、Pto、PAS 和Cs 的结果不稳定、耗时长（培养时间通常在30 d 以上）、检测结果易受含药管中实际药物浓度、MTB 悬液浓度、接种量和MTB 活力的影响等。

1.2 分枝杆菌液体培养DST 检测法

采用分枝杆菌液体培养DST 检测法检测MTB耐药性的结果与传统表型DST 检测方法具有较高的符合性，但检测时间较短（通常需要8 ～10 d）[5]。WHO 已认可应用该法进行部分二线抗结核药物〔如氧氟沙星(Ofx)、Km、Cm、Eto 等〕MTB DST检测的效果[6]。其缺点是检测仪器和试剂较为昂贵，且易被污染[7-8]。其优点包括可肉眼、自动化判读结果等[9]。

2 分子DST 检测方法

分子DST 检测目前已被公认为是DR-TB 的确诊项目之一[10]，其优点是检测时间短(2 ～48 h)、敏感度高，能从MTB 分离株、预处理的涂阴或培阴临床标本中检出MTB 耐药基因突变。需要注意的是，在进行相关标本处理或分离株前处理时存在较高的生物安全风险，但在进行标本液化时和完成DNA 提取后，安全风险是很低的。此检测方法的其他缺点包括：1）检测仅限于部分耐药基因型，应用范围受限[11]；2）难以检出异质性耐药[12]，表型DST 低水平耐药菌株可能无法被检出；3）会检出不影响耐药表型的同义突变( 氨基酸无改变)、沉默突变( 不影响编码蛋白的表达)[13]，产生假阳性结果（但这种情况的发生概率很低）；4）无法检出所有表型的MTB 耐药菌株[14]；5）检测成本较高。可见，此检测方法无法替代传统的表型DST 检测方法，仅可起到一定的补充作用。

2.1 实时荧光定量PCR 技术

采用实时荧光定量PCR 技术进行DST 检测具有检测时间短、自动化程度高，既能检测MTB 基因，又能辨别RFP 常见耐药决定区域[15]，检测可信度高等优点。在进行该检测时，核酸片段提取、变性退火延伸、检测分析产物等步骤均能实现自动化，操作不繁琐，检测所需时间在100 min 左右。可直接对固体或液体培养物进行检测，除血液标本外，其他临床标本（如痰、固/ 液培养物、肺外结核标本）均可检测。其传染风险低，产生气溶胶的几率小。但目前只能检测RFP 的耐药性，并不能区分具体的突变类型。

2.2 荧光PCR 探针熔解曲线法

采用荧光PCR 探针熔解曲线法可检测MTB对多种抗结核药物（如异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇及氟喹诺酮类药物）的耐药性[16]。其优点是操作简便、检测时间短。其缺点是检测结果易受到探针GC 含量、金属离子浓度、杂交温度等多种因素的影响，且不能区分具体的突变类型。

2.3 基因芯片技术

采用基因芯片技术能快速、准确地检测出MTB 对利福平及异烟肼的耐药性。此技术可用于鉴别各种分枝杆菌[17]。有研究指出，利用基因芯片技术能够快速检出MTB 对RFP 和INH 耐药的常见基因型，并可明确突变的具体位点和性质。进行相关检测的耗时仅为1 ～2 d。大量的研究表明，此技术在诊断MDR-TB 中的应用价值较高。其缺点是进行杂交、检测过程中的工序繁琐，所需技术熟练程度较高，且试剂较贵。

2.4 反向杂交技术

利用反向杂交技术可同时快速检测MTB 对RFP、INH、EMB、FQs、Am、Km 和Cm 的 耐药性[18]，明确相关基因突变的具体位点和性质，并可对MDR-TB、pre-XDR-TB 和XDR-TB 进行鉴别诊断。进行相关检测的耗时仅为1 ～2 d。但由于其属于开放性检测，容易产生气溶胶，且杂交、显色过程操作繁琐，不易控制。

2.5 基因测序技术

利用基因测序（whole-genome sequencing,WGS）技术能够高效便捷地检测出MTB 对RFP和INH 的耐药基因型，明确相关基因突变的具体位点和性质，从而能够为精准诊疗提供有益参考。但进行相关检测的准入成本较高，经验及技术人员相对缺乏[19]，目前在基层、乃至多数地市级定点医院尚无法广泛开展。

3 小结

目前，无论是表型DST 检测方法还是分子DST 检测方法，均无法单一满足临床需求。低浓度MTB 易导致表型DST 检测与分子DST 检测的结果不一致。用表型DST 检测方法和分子DST 检测方法检测RFP、INP、FQs 抗结核耐药性的准确度较高，其他药物的DST 检测需结合临床。表型DST 和分子DST 对二线抗结核药物的DST 检测结果均不稳定。传统表型DST 检测是检测MTB 的金标准，但也有其局限性。分子DST 检测可作为快速筛查MTB 的方法和（或）传统表型DST 检测的补充。采用多种方法联合检测能提高MTB 的检出率、缩短诊断时间，但会增加TB 患者的检测费用。《结核分枝杆菌耐药性检测专家共识》[20]中提出了一种进行MTB 耐药性检测的策略( 见图1)，旨在为DR-TB 的早期明确诊断及治疗提供实验室依据。

图1 一种进行MTB 耐药性检测的策略

综上所述，对于疑似DR-TB 患者，临床上应选择合适的DST 方法对其进行耐药性联合检测。相关研究人员应努力寻找更有效的MTB DST 检测方法，以便为DR-TB 的快速、准确诊断和早期有效治疗提供可靠的实验室依据。