显微介导鳜基因镜鲤F1 代肌肉中蛋白质和氨基酸组成与含量

闫学春，栾培贤，吴学工

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

鱼类种间、属间的物种之间的杂交统称为鱼类远缘杂交。远缘杂交是常规育种中引进可利用的优良外源基因，提供种质创新的有效途径之一。它可以实现两个物种间的基因转移，使其后代的表现性状和与表现型相关的基因组成发生改变，在鱼类的遗传育种和进化中表现出重要作用[1]，也极大丰富了鱼类的遗传基础，在鱼类的育种领域中运用广泛[2-12]。在鱼类育种中，远（近）缘种属作为改良鱼类遗传组成的一个巨大基因库，蕴藏着许多对鱼类改良极其有用的基因（如优良蛋白质、氨基酸品质、抗病性等）。因此，利用远缘杂交将近（远）缘种属有利基因导入鱼类，打破了其遗传稳定性，使双亲的有益性状重新组合，可以大大拓展鱼类的遗传基础，从中选出新品种和新种质，对鱼类遗传理论研究和育种工作具有重要意义。但在远缘杂交的亲本之间遗传关系相对较远，甚至超远缘的物种间多基因复杂性状（如数量性状）的转移比较难于实现，而鱼类显微介导远缘杂交（distant hybridization）技术弥补了远缘杂交的不足。该技术是将未经遗传修饰的外源总DNA 直接导入受体鱼受精卵内，越过了染色体数目不同存在着DNA 分子差异性排斥而造成的远缘杂交中亲本的不亲和性和子代不育等自然障碍，从而直接实现了基因水平的远缘杂交[13,14]。因此，显微介导远缘杂交技术具有获得鲤科鱼类品质改良新品种的可行途径[15]。有关鱼类外源总DNA 的导入技术已有过报道[16,17]。

鱼类是重要的优质蛋白源，为人类提供了重要的食物来源。镜鲤（Cyprinus carpio）属鲤科鲤属，自西德引进，多栖息水域中下层，杂食性，鳞片少，体型较粗壮，生长速度快，含肉率高，适合在中国推广养殖[18]。鳜（Siniperca chuatsi）属真鲈科鳜属，在中国南北方的水系里均有分布，生活在水清的江河湖泊的近底层，是典型的肉食性鱼类，肉多刺少，肉洁白细嫩，呈蒜瓣状，肉实而鲜美，是淡水鱼中上等食用鱼[19]。因此，将鳜的优良基因导入镜鲤体内，对改善镜鲤肉质具有重要意义。本研究在检测外源DNA确定整合的基础上[20]，测定和评估了F1代显微介导鳜基因镜鲤肌肉的营养成分和营养价值，可为开展鱼类肉质改良研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 显微介导鳜基因镜鲤

实验鱼取自1 龄F1代显微介导鳜基因镜鲤和普通镜鲤，每组鱼各取30 尾，提取肌肉。显微介导鳜基因镜鲤的制作方法参照闫学春等（2011）[15]。

1.1.2 鳜基因组DNA 提取

在鳜的尾部抽取血液，采用酚/氯仿抽提法，55℃水浴消化，无水乙醇沉淀，TE 溶解，4℃冰箱保存备用。具体提取方法参见闫学春等（2018）[16,17]。

1.2 方法

1.2.1 外源基因导入

在当年镜鲤的繁殖季节，人工繁殖中采集高质量的卵和精液，混合受精后，利用显微操作仪对黏附在培养皿上的受精卵（第一次卵裂期）进行显微注射，注射量为1 nL[21]。

1.2.2 取样方法

取实验鱼和对照鱼两侧背部肌肉，去除表皮和鳞片，称重，做好标记，放入-40℃冰箱保存，备用。样品的粗蛋白质、粗脂肪、灰分、水分和氨基酸含量均由农业农村部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）测定。

1.2.3 常规营养成分测定

采用马福炉灰化法（国家标准：GB5009.4-2010）测定灰分含量；采用索氏抽提法（国家标准：GB/T5009.6-2003）测定粗脂肪含量；采用凯氏微量定氮法（国家标准：GB5009.5-2010）测定粗蛋白质含量；采用直接干燥法（国家标准：GB5009.3-2010）测定水分含量。

1.2.4 氨基酸测定

对17 种氨基酸的测定，均采用国家标准：GB/T5009.124-2003 盐酸水解法测定。色氨酸在酸水解过程中被破坏而无法检出。

1.2.5 营养评价

采用1973 年FAO/WHO 建议的鸡蛋蛋白模式和氨基酸评分标准模式的比较，通过下方公式求得[22-25]，AAS（氨基酸评分）、CS（化学评分）和EAAI（必需氨基酸指数）。数据采用SPSS 软件进行统计分析，用t-检验法分析差异显著性，结果以平均值±标准差（x±s）表示。

式中，Sn为鸡蛋蛋白质的氨基酸；n 为比较的氨基酸数；tn为实验蛋白质的氨基酸。

2 结果与分析

2.1 主要营养成分

实验鱼与对照鱼的营养成分见表1 和图1。由表1 可知，实验鱼的蛋白质含量显著高于对照鱼（P＜0.05），而脂肪含量低于对照鱼，无显著差别（P＞0.05）。两种鱼灰分和水分含量基本一致，无显著差别（P＞0.05）。

表1 F1 代显微介导鳜鱼基因镜鲤与普通鲤的肌肉营养成分比较（/%鲜重）Tab.1 Comparison of muscle nutrition composition between the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control common mirror carp

图1 显微介导鳜基因的镜鲤F1 代与普通镜鲤的蛋白质含量Fig.1 Protein content in the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

2.2 氨基酸

显微介导鳜基因镜鲤子代的氨基酸总含量（质量分数）为79.77%，高于普通镜鲤的74.53%，经数理统计分析，有显著差别（P＜0.037）（表2）。其中谷氨酸（Glu）含量为所测的17 种氨基酸中含量最高（分别为12.78%和11.72%）。而含量较多的5 种氨基酸依次为谷氨酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp）、赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）和精氨酸（Arg）。

表2 显微介导鳜基因镜鲤F1 代与对照镜鲤的氨基酸含量（g/100g DW）Tab.2 Amino acid contents in muscle in the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

在所测的17 种氨基酸（色氨酸除外）中，还包括人体必需的苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、亮氨酸（Leu）、苏氨酸（Thr）和异亮氨酸（Ile）等7 种氨基酸[26,27]。显微介导鳜基因镜鲤子代的必需氨基酸含量为32.71%，占氨基酸总量的41.01%；普通镜鲤的必需氨基酸含量为30.48%，占氨基酸总量的40.90%。

显微介导鳜基因镜鲤子代肌肉中鲜味氨基酸为天门冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly），其总含量（30.07%）占氨基酸总量的37.70%，普通镜鲤的鲜味氨基酸总含量为28.12%，占氨基酸总量的37.73%。经比较，显微介导鳜基因镜子代的4 中鲜味氨基酸含量和总量都高于普通镜鲤，经数理统计分析，谷氨酸和天门冬氨酸差异显著（P＜0.05）。有显著差异的还有丝氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和组氨酸（P＜0.05）（图2、图3）。

图2 显微介导鳜基因镜鲤F1 代与普通镜鲤的4 种鲜味氨基酸比较Fig.2 Comparison of four kinds of flavor amino acid between the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

图3 显微介导鳜基因镜鲤F1 代与普通镜鲤的5 种氨基酸比较Fig.3 Comparison of top five amino acid between the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

2.3 营养价值评定

以WHO/FAO 制定的鸡蛋蛋白模式和氨基酸评分标准模式为标准[28-29]，分别计算实验鱼与对照鱼的AAS、CS、EAAI（表3 和表4）。在氨基酸评分中，两种鱼的缬氨酸（Val）均为第一限制性氨基酸，蛋氨酸＋胱氨酸（Met＋Cys）均为第二限制性氨基酸；在化学评分中，两种鱼中的蛋氨酸＋胱氨酸（Met＋Cys）均为第一限制性氨基酸，缬氨酸（Val）为第二限制性氨基酸。实验鱼的必需氨基酸指数为73.64，高于对照鱼的68.71。

表3 F1 代显微介导鳜基因镜鲤与普通镜鲤肌肉必需氨基酸含量Tab.3 Muscle essential amino acid contents in the F1 generation micro-injected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

表4 F1 代显微介导鳜基因镜鲤与普通镜鲤的AAS、CS 和EAAI 比较Tab.4 Comparison of amino acid score,chemical score and essential amino acid index between the F1 generation microinjected exogenous gene mirror carp and the control mirror carp

3 讨论

3.1 显微介导鳜基因镜鲤子代的主要营养成分

影响鱼肉品质的因素较多，主要包括遗传、营养、环境等，而粗蛋白质、粗脂肪、灰分等在鱼肌肉质量的评价中起决定性作用。蛋白质是构成生命的基本物质，也是人类的主要食物成分，可以直接反映鱼肌肉的营养价值。脂肪是人体热能的重要来源，也是体内脂肪酸的主要来源，灰分的含量则是肌肉中微量元素和矿物质含量的标志。本研究中，显微介导鳜基因镜鲤子代的蛋白质含量为18.69%，显著高于普通镜鲤17.45%（P＜0.05），而脂肪含量为2.63%，低于普通镜鲤的2.93%，没有显著差别，灰分和水分与普通镜鲤没有差别。至于导致镜鲤蛋白质含量增高的原因，是否是整合进入受体基因组的某段基因得到了表达，而表达的正是鳜控制蛋白质合成的那段基因[30]，还有待进一步分析验证。

有关外源总DNA 导入对动植物蛋白的影响都有报道。如闫学春等[15,30]在导入未经遗传修饰的中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）总DNA 的鲤的粗蛋白质含量显著高于对照鲤，粗脂肪含量显著低于对照鲤。在植物方面，如吕英海等[31]研究发现，导入大豆（Glycine max）总DNA 的大麦（Hordeum vulgare）籽粒中蛋白质含量明显提高，没有发现表型变异现象。通过对显微介导鳜基因镜鲤的研究，也为改良鱼类肌肉肉质提供了一条新途径。

3.2 显微介导鳜基因镜鲤子代氨基酸含量分析和营养价值

氨基酸种类组成和含量是衡量鱼类肌肉营养价值的体现。本研究结果表明，显微介导鳜基因镜鲤子代的氨基酸总含量、鲜味氨基酸和必需氨基酸含量均显著高于普通镜鲤；谷氨酸、天门冬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和赖氨酸显著高于普通镜鲤（P＜0.05），而丝氨酸、缬氨酸和组氨酸差异极显著（P＜0.01）。谷氨酸和天门冬氨酸是鱼肉里鲜味的特征氨基酸，反映了鱼类肌肉的鲜美程度。显微介导鳜基因镜鲤子代的必需氨基酸含量与总氨基酸含量的比值（WEAA/WTAA）为41.01%，而WEAA（必需氨基酸含量）与WNEAA（非必需氨基酸含量）的比值为69.54%。根据FAO/WHO 的理想模式，质量较好的蛋白质组成氨基酸的必需氨基酸含量与非必需氨基酸含量的比值在60%以上，而WEAA/WTAA为40%左右[32-36]，可见显微介导鳜基因镜鲤子代肌肉中氨基酸的组成符合优质蛋白质标准。显微介导鳜基因镜鲤子代肌肉必需氨基酸总量高于WHO/FAO 模式，低于鸡蛋模式，而普通镜鲤低于WHO/FAO 和鸡蛋模式，说明显微介导鳜基因镜鲤子代肌肉的必需氨基酸含量丰富，其组成和比例与标准接近。根据AAS 预测，显微介导鳜基因镜鲤子代和对照镜鲤肌肉的第一限制氨基酸都是缬氨酸，第二限制氨基酸都是蛋氨酸+胱氨酸；根据CS 预测，两种鱼的第一限制氨基酸都是蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸都是缬氨酸。而第一限制氨基酸缬氨酸和蛋氨酸及人体第一限制性氨基酸赖氨酸在显微介导鳜基因镜鲤子代中含量丰富，显著高于对照镜鲤，可在蛋白质营养上对人体起到补缺作用。显微介导鳜基因镜鲤子代和对照镜鲤的必需氨基酸指数分别为73.64 和68.71，说明其蛋白质营养价值要高于对照镜鲤。这表明，利用显微介导远缘杂交技术将鳜基因组DNA 导入受体镜鲤，通过两种基因组水平的远缘杂交，而提高镜鲤的氨基酸含量对改良镜鲤肉质，培育出镜鲤养殖新品种提供了理论参考[30]。有关利用外源基因导入而提高氨基酸含量的也有过报道。如闫学春等[37]将河蟹（Eriocheir sinesis）基因组DNA 导入镜鲤后其子代肌肉中的氨基酸含量，均高于普通镜鲤，两种镜鲤的第一限制性氨基酸都是缬氨酸,与普通镜鲤相比较，显微介导河蟹基因的镜鲤具有一定的营养优势。

成功的鱼类转基因主要是通过显微操作将单一性状的目的基因导入单个细胞，以改变受体鱼的一些简单性状，如抗病性状[38]、生长性状等[39,40]，其结果往往比常规育种在后代的筛选工作中具有较强的目的性。而鱼类的一些经济性状，如数量性状等多为多基因控制，寻找将一复杂性状的多个基因同时导入到受体鱼中，以达到引入新的多基因复杂性状来达到改良性状目的的新方法，必然具有实际的重要价值[41]。在显微介导外源总DNA 转移中，供体的外源DNA 能提供完整的基因信息，这为显微介导远缘或超远缘基因间的转移，特别是鱼类间性状多而杂的多基因转移提供了有力的条件[42,43]。本研究结果对于是否影响显微介导鳜基因镜鲤更为精细和复杂的代谢变化，以及是否对蛋白质合成与分解产生了影响，以及对这些基因系统的复杂和调节机理的了解，都还需要做进一步的深入研究。

3.3 结论

本研究依靠显微介导远缘杂交技术，将未经遗传修饰的鳜总DNA 导入镜鲤受精卵内并获得子代。对显微介导鳜基因镜鲤的AFLP 分析和阳性片段的测序，在分子水平上证明了镜鲤整合了鳜DNA。在确定其稳定遗传的基础上，测定了显微介导鳜基因镜鲤F1代和普通镜鲤肌肉的营养成分。发现显微介导鳜基因镜鲤F1代的氨基酸和蛋白质含量均高于普通镜鲤，且符合FAO/WHO 标准的要求。研究结果为显微介导鳜基因镜鲤的品质改良提供科学的理论依据。