样品保存液对组织样品中PRRSV 核酸保存的影响

张耀丹

（勃林格殷格翰动物保健（中国）有限公司，上海 201203）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS） 俗称猪蓝耳病，是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的全球养猪业最具挑战性的病毒性疾病之一。PRRSV 毒株具有多样性并且因为容易变异、感染时间长等特征，导致防控难度较大。该病在我国已经流行20 多年，至今感染率仍居高不下，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。目前，在非洲猪瘟肆虐的大环境下，PRRS 的防控依然是全世界养猪业十分关注的重大难题之一。在PRRS 的防控过程中，对PRRS 及时且准确地监测是做好防控的重要前提。实验室的抗原检测在多种PRRS 检测方法中扮演着十分重要的角色，同时也是评判各项防控措施是否有效的参考标准。PRRS 抗原检测不仅能够了解PRRS 的病毒含量和鉴定毒株的类型，还能反映出PRRSV 的感染程度以及确定PRRSV 的感染时间等，以便从源头解决问题。因此，PRRS抗原检测结果的准确与否，对该病的有效控制非常重要, 所以也备受关注。

PRRS 抗原检测的重要方法之一是逆转录实时荧光定量RT-qPCR（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）， 其 灵 敏度比常规逆转录聚合酶链式反应高约100 倍，因此被广泛用于检测临床组织样品、血清及精液中PRRSV核酸。相较于其他样品类型，组织样品的检测流程最为复杂。组织匀浆处理需要很多前期准备工作，如剪刀、镊子、离心管和不锈钢珠的高压灭菌、烘干等；之后需称量一定重量的组织，用剪刀剪碎后，加钢珠置于研磨仪中研磨，研磨后置于低温离心机中离心，取上清后才能进行病毒核酸的提取。整个过程需要持续在低温环境进行，离心管、钢珠和PBS（磷酸缓冲液）需提前预冷，操作时必须在冰盒上进行。如果样本研磨处理过程不能持续保持低温, 样本中的核酸得不到有效保护，容易导致病毒核酸发生降解，从而出现假阴性，检测结果的真实性就难以得到保证。因此，组织样品中病毒核酸样品的提取及保存对检测结果至关重要，而与其相关的研究较少。样品保存液中一般由用于培养细胞和细菌的基础缓冲液、平衡盐或蛋白缓冲液组成，其中的蛋白质可有效防止病毒核酸的降解。本研究采用RT-qPCR 方法，利用PRRS 阳性组织样品比较了组织样品保存液与传统的研磨匀浆处理两种方法对PRRSV 核酸的保护效果。结果发现样品保存液对PRRSV核酸在常温甚至是高温条件下长时间保存的保护效果比较理想，因此建议在对组织样品核酸检测前可以直接使用样品保存液对病毒核酸进行保护。

1 材料方法

1.1 组织样品的来源

组织样品来自某猪场，已知PRRSV 阳性的猪肝脏、肾脏、脾脏混合样品。

1.2 试剂与仪器

扶思得病毒保存液、Gibco 磷酸盐缓冲液（PBS，不含Ca2+、不含Mg2+）、ABI 厂家5XMagMAX ™Core 核酸提取试剂盒，ABI 厂家PRRSV 分 型 NA 和 EU 荧 光 定 量PCR 检测试剂盒、QIAGEN Tissue Lyser II 型组织研磨仪、Thermo Scientif ic Kingf isher Flex 核酸提取仪、ABI 厂家7500 荧光定量PCR仪等。

1.3 样品处理与核酸提取

将含PRRSV 的组织样品平均分为2 组，1 组进行匀浆机研磨处理作为对照组，1 组加入保存液浸泡处理作为实验组。

1.3.1 样品处理

将上述研磨处理组样品，平均剪成3 份称量约为0.5 g 的块状，用灭菌后的剪刀剪碎；各加入1 mL 预冷的PBS 和1 颗直径5 mm 的无菌钢珠；随后将EP 管装入研磨仪适配器中进行匀浆，以28 Hz 的频率，2 min 内重复6 次；随后12 000 r/min，4℃离心5 min，将上清分别置于4 ℃、25 ℃和37 ℃中保存，并在第0 天、第1 天、第3 天和第7 天的同一时间点分别取样检测。

将另1 份保存液组样品平均剪成3 份约1 cm3大小的块状，分别浸泡在3 mL 的保存液中，至于4℃、25℃和37℃中保存，并在第0 天、第1 天、第3 天和第7 天的同一时间点分别取样。

1.3.2 核酸提取

取样完成后，使用ABI 厂家5XMagMAX ™ Core 核 酸 提 取 试剂盒和Thermo Scientif ic Kingf isher Flex 核酸提取仪进行核酸提取。

1.4 荧光定量PCR 检测

使 用ABI 厂 家PRRSV NA 株和EU 株分型荧光定量PCR 检测试剂盒进行荧光定量PCR，按照表1体系配置预混液：10.5 μL/孔，分装在PCR 专用96 孔板中，加入5 μL 样品核酸，封膜后离心。

表1 预混液

设置反应程序，结束后保存结果（表2）。

表2 反应程序

2 结果

2.1 保存时间对PRRSV 核酸检出量的影响

保存液组在各个温度条件下，第0 天到第7 天时PRRSV 核酸检测量差异不大（见表3），核酸检出量不因样品保存时间的延长而降低。匀浆组在各个温度条件下保存时，在第0 天、第1 天、第3 天时，病毒核酸检出量呈缓慢减少的趋势；当保存至第7 天时，病毒核酸检出量明显减少，最大相差5.1 个Ct 值（约34 倍）。

表3 不同保存时间和不同保存温度下PRRSV 核酸检测结果

2.2 保存温度对PRRSV 核酸检出量的影响

保存液组PRRSV 核酸检出量受温度影响变化不大；而匀浆组在4℃保存测得Ct 值比25℃保存低4.5 个Ct 值（检出量约高22 倍），4℃保存测得Ct 值比37℃保存低约12 个Ct 值（检出量约高4 100 倍）。

2.3 病毒核酸保存效果评价

在4℃条件下，匀浆液第0 天、第1 天、第3 天Ct 值最低，检出量最高，病毒核酸保存效果最好；其次是25℃和37℃在第0 天、第1 天、第3 天和第7 天的保存液，比4℃条件下匀浆液第0 天、第1 天、第3 天高约2.6 个Ct 值（约6 倍）；最不理想的保存条件是高温条件下保存的匀浆液样品，随着温度升高和时间延长，核酸逐步降解，甚至检测结果为阴性。

3 讨论

PRRS 是一种感染率高、发病急、病死率高的接触性传染病。该病在我国自1996 年首次报道以来，已广泛流行于全国各省，造成怀孕母猪流产、早产、产死胎、弱胎及断奶仔猪肺炎等，给我国养猪业造成了不可估量的经济损失。经研究发现引起该病的病原为PRRSV。PRRSV 对温度较敏感，低温下保存的PRRSV 具有较好的稳定性，而干燥的环境中则迅速失去活力，通常在37℃下能保存48 h，50℃下则45 min 就失去感染性。

在病毒感染的情况下，如果能及时并且准确地鉴定出病毒的存在，则可以采取有效的措施阻止病毒的扩散传播，从而可以大大减少由此带来的经济损失。逆转录实时荧光定量RT-qPCR，被广泛用于检测临床组织样品、血清及精液中PRRSV 核 酸。但 针 对PRRSV 的检测有诸多的局限，其中病毒样品的保存是病毒检测过程中关键的挑战。由于实践中，PRRSV 样品的检测往往需要运送至距离相对较远的、具备检测条件的实验室进行检测。传统的运输条件需要放置干冰或冰袋运输。干冰运送成本较高，而且对于偏远的养殖场且不宜获得；足够数量的冰袋可以暂时提供低温环境，但冬季运输时间超过1 ～2 d，夏季超过几个小时冰袋就会发生融化。实验室处理组织不仅需要提前对剪刀、镊子和钢珠进行灭菌处理，还需提前预冷PBS、钢珠、研磨仪适配器和离心机，研磨结束需再次清洗使用的器械，并进行灭菌处理。如果样品处理时间过长，或处理的环境温度略高，样品的质量就会受到影响，从而可能加速病毒RNA 降解, 容易在检测过程中出现假阴性结果，影响检测的真实性；研磨过程使用的剪刀、镊子和其他耗材增加了样品交叉污染的可能，不利于生物安全，也影响检测结果的真实性。因此适当的样品运输和保存处理方法尤为重要，而关于样品运输和保存相关的实验数据有限。

本研究发现对于含PRRSV 的组织，保存液直接浸泡即可释放出病毒核酸，并且病毒核酸的检出量不会随温度的升高和保存时间的延长而减少，即使在37℃高温条件下保存7 d，病毒核酸的检出量仍与4℃、25℃保存的检出量基本一致。虽然匀浆后的组织样品在4℃条件下病毒核酸检出量比浸泡在样品保存液中的样品略高（约6倍），但对于病毒载量高的样品来说检测结果仍然十分可靠；并且比起25℃和37℃条件下，匀浆液中病毒核酸检出敏感度超过2 000 倍，保存液的保存更具优势。匀浆液的保存对低温和时间控制有严格的要求，保存温度越高，保存时间越长，核酸降解的越快。在实践中，样品运输过程的质控面临着严峻的挑战，组织样品的匀浆过程不仅大大增加了样品预处理的时间，也承担着样品流转过程中低温环境难以维持的风险。相比之下，使用保存液处理样品时，只需养殖场的工作人员将组织样品剪成1 cm3左右的块状物并浸泡于保存液中，便可常温运输到实验室；实验室检测人员在检测时只需抽取部分保存液即可进行核酸提取，在保证病毒核酸检测稳定的前提下大大减少了工作量。