生菜中金黄色葡萄球菌生长模型的建立

瞿 洋,宇盛好,白亚龙,林 婷,周昌艳,索玉娟∗

(1 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 201403;2上海市市场监督管理局信息应用研究中心,上海 200233)

在我国,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的20%—25%,该菌是仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌的第三大食源性致病菌[1]。 金黄色葡萄球菌能产生耐高温的肠毒素,由肠毒素引起的食物中毒表现有恶心、呕吐、腹痛和腹泻等症状[2-3]。 一般认为金黄色葡萄球菌浓度大于105CFU∕g(mL)时会产生肠毒素,进而引发食物中毒[4-6]。 因此,预测金黄色葡萄球菌在特定环境下的污染水平,对保证食品安全具有重要意义。

生菜是我国消费最多的一类即食蔬菜,近年来随着人们对膳食营养需求的提升,其市场需求不断扩大[7]。 由于高水分、多气孔和易损伤等特点,生菜极易受到食源性致病菌的污染[8]。 2018—2019 年,美国因生菜污染食源性致病菌接连爆发了食物中毒疫情,患病人数累计277 人[9]。 为预防此类食物中毒的发生,国内外已先后开展了构建鲜切生菜中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌和细菌总数预测微生物模型的研究[10-15]。 目前,金黄色葡萄球菌在生菜中的生长行为尚不清楚(金黄色葡萄球菌现有研究多集中于肉制品、米面制品和乳制品中[16-18])。 国内外研究均显示,金黄色葡萄球菌是生菜中常见的食源性致病菌[19-21]。 我国食品中致病菌限量标准GB 29921—2013 规定,即食果蔬制品中金黄色葡萄球菌的最大限量为103CFU∕g(mL)。

为评估生菜产品在生产加工、储藏运输等过程中金黄色葡萄球菌的生长变化情况,本研究对有利福平抗性的金黄色葡萄球菌分离株进行生长测定,比较修正的Gompertz(SGompertz)模型和修正的Logistic(Slogistic)模型对其在生菜中生长的拟合度,获得其最大比生长速率和迟滞期。 在此基础上,采用Huangrate 模型和二次多项式模型建立生菜中金黄色葡萄球菌的二级生长模型,以期为生菜在运输及储藏过程中的定量风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

奶油生菜购于上海市奉贤区南桥镇超市和农贸市场;金黄色葡萄球菌为本单位自生菜中分离保存(经国标GB 4789.10—2010 分离鉴定和PCR 检测该菌的特异基因nuc 证实为金黄色葡萄球菌)。

Baird-Parker 培养基(BP)、磷酸盐缓冲液(PBS)为北京陆桥技术有限责任公司产品;胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、琼脂粉为英国Oxoid 公司产品;利福平(分析纯)为美国Sigma 公司产品。

1.1.2 主要仪器设备

高压灭菌锅(SX-500),日本Tomy Digital Biology 公司;生物安全柜(1300 SERIES A2 型),美国Thermo公司;恒温培养箱(Medcenter Einrichtungen GmbH 型),德国Friocell 公司;恒温振荡培养箱(TQZ-312 型),上海精宏实验设备有限公司;电子天平(AL104),瑞士Mettler Toledo 公司;漩涡混匀仪(Vortex Genie 2),美国Scientific Industries 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株利福平抗性诱导

金黄色葡萄球菌生菜分离株接种于BHI 液体培养基,37 ℃摇床过夜培养,将其按照1∶100 接种于含利福平的BHI 液体培养基中进行耐受性诱导。 利福平质量浓度为0、5 mg∕L、10 mg∕L、20 mg∕L、40 mg∕L、80 mg∕L、100 mg∕L、120 mg∕L。

1.2.2 金黄色葡萄球菌的接种、培养及计数

金黄色葡萄球菌分离株在BHI(含100 mg∕L 利福平)培养基中过夜培养至稳定期,经10 倍梯度稀释至103CFU∕mL 制成接种液。 选取市场新鲜生菜样品,制成鲜切生菜[22],具体做法为:去除外层叶片,风干,切成约4 cm×4 cm 大小,每份称取约10 g 鲜切叶片置于均质袋中备用。 吸取1 mL 接种液于鲜切生菜上,分别置于15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和40 ℃的恒温恒湿培养箱中培养,每隔一段时间取出1 份样品加入90 mL 无菌生理盐水,采用平板计数测定菌落数[23]。 每个温度进行3 组平行试验,测定终点为金黄色葡萄球菌生长达到稳定期。

1.2.3 生菜中金黄色葡萄球菌一级生长模型的建立

修正的Gompertz(SGompertz)模型和修正的Logistic(Slogistic)模型[24]均为经典的一级生长模型,其中Slogistic 模型简单方便,适用于环境简单、食品成分单一的情况;SGompertz 模型采用双指数函数,同时考虑了迟滞期对模型的影响,适用于适温下致病菌的生长[25-26]。 本研究中生菜培养环境简单,营养成分单一,叶片结构复杂,而金黄色葡萄球菌符合迟滞期生长规律,所以优先选用这两种模型拟合生菜中金黄色葡萄球菌的生长,计算相应的最大比生长速率和迟滞期。

1.3 数据处理

采用Excel 2003 软件进行数据处理,应用Origin 8.5 和IPMP 2013 软件制图。

2 结果与分析

2.1 菌株利福平抗性诱导

金黄色葡萄球菌生菜分离株在所有利福平筛选质量浓度(0、5 mg∕L、10 mg∕L、20 mg∕L、40 mg∕L、80 mg∕L、100 mg∕L、120 mg∕L)下生长良好(OD600>0.8),故本试验金黄色葡萄球菌生菜分离株利福平最高耐受质量浓度为120 mg∕L。 生菜叶片上的背景菌在含有100 mg∕L 利福平的BP 平板上无明显生长,为确保金黄色葡萄球菌利福平抗性的稳定,选用耐受100 mg∕L 的金黄色葡萄球菌诱导株进行后续试验。

2.2 生菜中金黄色葡萄球菌生长的一级模型

选用SGompertz 和Slogistic 模型分别拟合15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和40 ℃下金黄色葡萄球菌的生长曲线(图1—5),其模型拟合参数见表1。 结果显示,SGompertz 模型的R2值均优于Slogistic 模型,说明SGompertz 模型的拟合度较高;SGompertz 模型的RMSE 值均小于Slogistic 模型,说明SGompertz 模型的误差较小。 R2值和RMSE 值结果均表明SGompertz 模型能更好地拟合不同温度下金黄色葡萄球菌在生菜中的生长,因此本研究最终选择SGompertz 模型作为金黄色葡萄球菌最适的一级生长模型(表2)。

图1 15 ℃时生菜中金黄色葡萄球菌生长曲线的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.1 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 15 ℃

图2 25 ℃时生菜中金黄色葡萄球菌生长曲线的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.2 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 25 ℃

图3 30 ℃时生菜中金黄色葡萄球菌生长曲线的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.3 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 30 ℃

图4 37 ℃时生菜中金黄色葡萄球菌生长曲线的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.4 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 37 ℃

图5 40 ℃时生菜中金黄色葡萄球菌生长曲线的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.5 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 40 ℃

表1 生菜中金黄色葡萄球菌的一级生长模型拟合参数Table 1 Fitting parameters of primary growth model of S.aureus in lettuce

表2 生菜中金黄色葡萄球菌的最适一级生长模型Table 2 Optimal primary growth model of S.aureus in lettuce

表3 可以看出,温度从15 ℃上升至37 ℃时,最大比生长速率从0.007 h-1上升到0.242 h-1,迟滞期从17.592 h 下降至1.827 h;当温度达到40 ℃时,最大比生长速率降低至0.145 h-1,迟滞期变大至2.140 h。

表3 SGompertz 模型得到的不同温度条件下的生长参数Table 3 Kinetic growth parameters estimated by SGompertz model at different temperatures

2.3 生菜中金黄色葡萄球菌二级生长模型的建立及评价

根据SGompertz 模型拟合得到金黄色葡萄球菌在不同温度下的μmax和λ,选用Huang-rate 模型和二次多项式模型作为二级模型,对温度与μmax、λ 的关系进行拟合(图6)。 评价结果(表4)显示,采用Huangrate 模型拟合的温度与μmax关系的R2为0.978、Bf为1.011、Af为1.018,表明该生长预测模型的预测误差[30]为1.77%。 采用二次多项式模型拟合的温度与λ 关系的R2为0.956、Bf为1.004、Af为1.035,表明该生长预测模型的预测误差为3.51%。 同时,从图6 可以看出,金黄色葡萄球菌在鲜切生菜中生长的最低温度为14.958 ℃,最高温度为40.193 ℃。

图6 温度与最大比生长速率μmax、迟滞期λ 的关系Fig.6 Relationship between temperature and specific growth rate or lag phase

表4 二级模型的评价Table 4 Various statistical characteristics of the secondary models

3 讨论与结论

本试验通过构建生菜中金黄色葡萄球菌的生长模型,获得了该菌在生菜中的生长规律,为金黄色葡萄球菌在生长中的定量风险评估提供了依据。 本研究表明,14.9 ℃可有效抑制金黄色葡萄球菌的繁殖,建议生菜在该温度及以下贮藏运输。

本研究构建模型的材料有两个特点:(1)试验菌株为生菜分离株,与标准菌株相比,菌株异质性因素造成的模型偏差较小;(2)生菜未经清洗消毒处理,通过在目标菌中引入抗性标记,排除了计数过程中统计生菜样品自身可能含有金黄色葡萄球菌的可能性,同时也还原了背景微生物对目标菌的生长可能存在协同或抑制作用[31],构建的模型更为真实客观。

朱奚慕[12]比较了鲜切生菜中沙门氏菌生长的4 种一级生长模型,发现SGompertz 模型更适合描述该菌在10 ℃以上的生长,与本研究选用SGompertz 模型作为金黄色葡萄球菌最适的一级生长模型结果相符。 同时,本研究发现,金黄色葡萄球菌在生菜中的最大比生长速率随着温度的升高先升后降;迟滞期随着温度的升高先降后升,该趋势与已有研究相符[32-34]。 该现象与微生物的细胞膜流动性有关,即温度越高,微生物的细胞膜流动性越强,运输营养物质越快,微生物不断得到营养物质的补充,有利于微生物的生长[35]。 若生长温度高至生菜出现变色、出水等变质现象时,营养物质的流失一定程度上阻碍了金黄色葡萄球菌的生长,相应地,最大比生长速率会降低,迟滞期会变大。

根据Ross[36]对偏差因子的划分标准,Bf在0.9—1.05,越靠近1,模型越可靠。 Braun 等[37]认为,Af值在1.0—1.9,模型均可接受。 根据上述理论,本研究选用的两种二级模型拟合度都较高。 后续可通过@RISK等软件将模型带入,计算运输和贮藏时特定温度下金黄色葡萄球菌在生菜中的污染水平,以掌握金黄色葡萄球菌在生菜中的生长规律,同时通过Spearman 等级分析获得温度、时间对污染水平的影响,为定量风险评估提供依据。

本研究显示,金黄色葡萄球菌在鲜切生菜中生长的最低温度为14.958 ℃,与Park 等[28]和刘晓慧等[19]的研究相符,但与该菌在模拟蟹肉[38]、原料乳[29]、即食米饭[32]中的最低温度(3.8 ℃、7.9 ℃、7.0 ℃)存在一定差异。 造成金黄色葡萄球在生菜中最低生长温度与其他食品存在差异的原因可能有以下两个方面:1)生菜叶脉、气孔密度、叶片表面疏水性及可溶性蛋白均会导致细菌在叶片上的黏附差异[8];2)生菜基质本身具有的如水分活度、营养物质、pH 等条件会影响其携带的目标菌的生存状态,从而影响金黄色葡萄球菌的生长[39]。

本研究中金黄色葡萄球菌在鲜切生菜中生长的最高温度为40.193 ℃,与李文杰等[38]在模拟蟹肉中金黄色葡萄球菌的最高生长温度(44.1 ℃)存在一定差异,原因主要有:(1)食品介质的差异;(2)理论上,模拟温度越接近细菌生长最高温度甚至高于最高温度,计算得到的最高生长温度值越准确。 由于生菜在40 ℃贮藏时出现了腐败变质现象,故没有在40 ℃以上取试验点。

综上,金黄色葡萄球菌在生菜中生长的二级模型为:μmax=0.021 ×(T -14.958)[1-e5.175(T-40.193)],λ=0.024 23T2-1.979 32T+42.124 97。 本研究也存在不足之处,即只进行了内部验证,比较了模型预测值和实测值,后期可利用Combase 等数据库的数据对二级模型进行评价及适当修正,使其更具普适应与说服力;另外,本研究构建的模型为恒温生长模型,后期也可开展波动温度下金黄色葡萄球菌在生菜中生长的研究。