柚皮总黄酮不同提取方法的比较*

叶燊茹，简梓晴，徐毅锋，叶伟璇，李海彬，罗 兰

(广州新华学院药学院，广东 广州 510520)

柚(Citrusmaxima(Burm.)Merr.)，为芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)水果，在我国的栽培历史悠久，品种繁多，资源丰富。柚全身都是宝，除果肉有丰富的营养和药用价值外，果皮和果核也具有较高的药用价值和重要的生物学功能[1-2]。目前柚主要以果肉鲜食为主，约占整个柚子总量40%～50%[3]的柚皮却多被丢弃，这不仅造成环境负担，更使柚皮中的特色次级代谢产物没有得到充分开发，导致严重的资源浪费现象。

已有研究报道，柚皮中黄酮类化合物含量丰富，其生物活性主要表现在抗氧化、抗病毒、降血糖、降血脂、降胆固醇、提高免疫力等，具有较高的保健和药用价值[4-5]。将废弃柚皮中黄酮类化合物进行提取利用，可为其后续全面开发及下游产品深加工提供科学数据，促进香精香料、食品添加剂、天然抗氧化剂、抗菌剂及降血糖功能食品等工业的发展[6-9]。

目前，对柚皮中总黄酮的提取方法，主要有超声法、利用酶的提取法、微波萃取法，其中以微波法和超声波法的研究居多[10-13]，但对柚皮中总黄酮提取方法进行比较的相关研究较少。因柚子品种品系繁多，其黄酮类成分含量不一，各文献提取方法所得的总黄酮提取率相差很大。综上，本研究以广西容县沙田柚柚皮为原材料，比较超声法、纤维素酶辅助法、微波消解法对总黄酮的提取率，得出最佳提取方法，并优化提取方法的工艺条件,为柚皮黄酮类化合物的研究和应用提供参考依据。

1 试药与仪器

1.1 试 药

柚皮(45 ℃下干燥后粉碎,广西省容县)；芦丁对照品(批号：191207，纯度：98%,中国药品生物制品检定所)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇等试剂均为分析纯，所用水为纯化水。

1.2 仪 器

UV-2201紫外可见分光光度计，日本岛津公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MARS6微波消解仪，CEM厂家；DFT-50型号手提式高速万能粉碎机。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取芦丁对照品50 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解完全，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得0.2 mg/mL芦丁对照品溶液。

2.2 样品溶液的制备

精密称取柚皮粉末2 g，置50 mL具塞锥形瓶中。分别采用超声法、纤维素酶辅助法和微波消解法进行提取，提取完毕后过滤，即得样品溶液。

2.3 芦丁标准曲线的绘制

精密量取芦丁对照品母液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，照上法配置无对照溶液的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在500nm波长处测定吸光度。吸光度为纵坐标(y)，芦丁浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，得回归方程为y=10.443x+0.0015，线性相关系数R2=0.9994，表明芦丁在检测浓度范围内线性良好，芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.4 柚皮总黄酮提取率的测定

吸取3 mL样品溶液,按“2.3”项下方法进行吸光度的测定。再根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的含量，通过以下公式计算样品中总黄酮的提取率。

式中:X为提取率,%；C为被测液中总黄酮的含量,mg/mL; W为样品的质量,g; D为稀释倍数；V为溶剂体积,mL。

2.5 超声法提取

2.5.1 单因素的考察

以柚皮总黄酮提取率为指标, 乙醇浓度(30%、45%、60%、75%、90%)、料液比(g:mL)(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)、提取时间(20、30、40、50、60 min)和提取温度(30、40、50、60、70 ℃)为考察因素进行单因素实验，结果见图2。

图2 超声法单因素实验结果Fig.2 Single factor experiment results of ultrasonic method

由图2可知，当料液比为1:15(g:mL)时,提取率达最大值。若溶剂量过少，总黄酮未充分溶解于乙醇；溶剂量增加则柚子皮粉末与溶剂的接触面增大，利于总黄酮的提取；而加入过多溶剂会导致物料吸收的超声能减少，总黄酮溶出不充分。柚子皮总黄酮提取率随提取时间的增加而上升，在50 min时提取率出现最高点。随着提取温度的增大，提取率先增大后减小,在60 ℃时提取率达峰值。提取温度过高乙醇易挥发，还可导致黄酮成分发生变化，分子结构受到破坏，从而降低总黄酮得率[14]。若乙醇浓度过小则部分水溶性杂质溶出，从而导致总黄酮提取率降低，因此随着乙醇浓度的不断增大，其提取率呈上升趋势。

2.5.2 正交试验

表1 超声法正交试验因素和水平Table 1 Factors and level of orthogonal test of ultrasonic method

表2 超声法 L9(34)正交试验结果(直观分析)Table 2 Ultrasonic method L9(34) orthogonal test results (intuitive analysis)

在单因素实验结果的基础上，以提取率为考察指标，对提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度进行正交试验，正交试验因素和水平如表1所示，正交试验结果与分析如表2、表3所示。

由正交试验直观分析结果可知，四个因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为：提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比。从方差分析结果可以看出，四个因素对提取率均无显著性影响。结合直观分析和方差分析，筛选出超声法提取柚皮总黄酮的最佳工艺条件为A2D1B2C3，即称取柚皮粉末，以1:25的料液比加入60%乙醇，在60 ℃下超声提取50 min。

表3 超声法正交试验方差分析结果Table 3 Results of ultrasonic orthogonal test variance analysis

2.6 纤维素酶辅助法提取

2.6.1 单因素的考察

以柚皮总黄酮提取率为指标, 酶解温度(10、20、30、40、50 ℃)、pH(3.5、4、4.5、5、5.5)、酶解时间(20、25、30、35、40 min)和纤维素酶用量(2.0、4.0、6.0、8.0、10 mg/g)为考察因素进行单因素实验，结果见图3。

由图3可知，溶液pH为5.0时，总黄酮提取率最高,说明纤维素酶在pH5.0溶液中活性最大，利于总黄酮溶出。pH增大，纤维素酶的酶解能力下降，破坏细胞壁结构的作用降低，导致总黄酮提取率降低。酶解温度在10～50 ℃范围内,总黄酮的提取率先增大后减小，温度达到40 ℃时，总黄酮提取率达最高值。酶解温度逐渐升高，酶活性也随之增大，对原料作用越充分，提取率越高；当温度超出纤维素酶的最适作用温度时，酶的活性会降低，从而使得总黄酮提取率降低。酶解时间在35 min时提取率达最大值，当提取时间增大至40 min时提取率下降。总黄酮提取率随酶用量的增加而增大,用量达6 mg/g时提取率达最大值0.93%。酶用量继续增加，提取率下降。当总黄酮成分在溶剂中的扩散达到平衡状态时提取过程已经完成，再增加酶用量或延长提取时间，不仅导致杂质溶出增加，还增大了已溶出的总黄酮成分的降解风险。

图3 纤维素酶辅助法单因素实验结果Fig.3 Results of single factor experiment with cellulase-assisted method

2.6.2 正交试验

表4 纤维素酶辅助法正交试验因素和水平Table 4 Factors and levels of cellulase-assisted orthogonal test

表5 纤维素酶辅助法L9(34)正交试验结果(直观分析)Table 5 Cellulase-assisted method L9(34) orthogonal test results (intuitive analysis)

在单因素实验结果的基础上，以提取率为观察指标，对pH、酶解温度、酶解时间、纤维素酶用量进行正交试验，正交试验因素和水平如表4所示，正交试验结果与分析如表5、表6所示。

表6 纤维素酶辅助法正交试验方差分析结果Table 6 Results of variance analysis of orthogonal test by cellulase-assisted method

由纤维素酶辅助法正交试验直观分析结果可知，四个因素对柚子皮黄酮提取率影响的主次顺序为:酶解温度>pH>酶解时间>酶用量。从方差分析结果可以看出，四个因素对提取率均无显著性影响。结合直观分析和方差分析，筛选出超声法提取柚皮总黄酮的最佳工艺条件为B3A3C2D1,即称取柚皮粉末，加入60%乙醇(调节pH至5.0)，加入4 mg/g的纤维素酶在50 ℃下提取35 min。

2.7 微波消解法提取

2.7.1 单因素的考察

以柚皮总黄酮提取率为指标, 乙醇浓度(55、65、75、85、95%)、提取温度(60、70、80、90、100 ℃) 、辐射时间(5、10、15、20、25 min)、料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)为考察因素进行单因素实验，结果见图4。

图4 微波消解法单因素实验结果Fig.4 Single factor experiment results of microwave digestion method

由图4可知，随着乙醇浓度升高，总黄酮提取率不断增大，在乙醇浓度为85%时有最大提取率。继续增大乙醇浓度，总黄酮提取率下降。总黄酮提取率在60～100 ℃范围内先增大后减小，70 ℃时提取率达最大值。当温度继续升高时，总黄酮成分被破坏，乙醇严重挥发，导致其提取率下降。随着提取时间的增大，总黄酮提取率逐渐升高，提取时间在20 min时提取率最高。将提取时间增加至25 min，总黄酮提取率下降。微波作用促进了总黄酮的溶解,但微波作用时间过长对总黄酮成分造成破坏的可能性增大[15]。随着乙醇量增加,提取率逐渐减小。在一定范围内增加溶剂量有利于总黄酮成分溶出，但料液比过大将导致在后续的操作中损失溶质，从而降低提取率。

2.7.2 正交试验

在单因素实验结果的基础上，以提取率为观察指标，对乙醇浓度、提取温度、辐射时间、料液比进行正交试验，正交试验因素和水平如表7所示，正交试验结果与分析如表8、表9所示。

表7 微波消解法正交试验因素和水平Table 7 Factors and level of microwave digestion orthogonal test

表8 微波消解法L9(34)正交试验结果(直观分析)Table 8 Microwave digestion L9(34) orthogonal test results (intuitive analysis)

表9 微波消解法正交试验方差分析结果Table 9 Microwave digestion method orthogonal test variance analysis results

由微波消解法正交试验直观分析结果可知，四个因素对柚子皮黄酮提取率影响的主次顺序为:乙醇浓度> 提取温度>辐射时间>料液比。从方差分析结果可以看出，四个因素对提取率均无显著性影响。结合直观分析和方差分析，筛选出超声法提取柚皮总黄酮的最佳工艺条件为A3B2C1D3,即称取柚皮粉末，按料液比1:20(g:mL)加入85%乙醇，在70 ℃下微波提取10 min。

2.8 不同提取方法的验证及结果比较

通过研究不同提取方法对柚皮中总黄酮提取率的影响，采用正交试验对不同的提取方法进行优化，并进行验证试验。结果表明：在超声法中，提取温度60 ℃、提取时间50 min、料液比1:25(g:mL)，此条件下柚皮总黄酮提取率为1.04%；纤维素酶辅助法中，pH 5.0、料液比酶解温度50 ℃、酶解时间35 min，此条件下柚皮总黄酮提取率为1.10%；微波消解法中，料液比1:20(g:mL)、乙醇浓度85%，提取温度70 ℃、提取时间10 min，此条件下柚皮总黄酮提取率为1.25%。由结果可知三种方法提取油皮总黄酮的提取率为微波消解法>纤维素酶辅助法>超声法，如图5所示。

图5 不同提取方法的验证及结果比较Fig.5 Verification of different extraction methods and comparison of results

3 讨 论

微波消解法提取时内外同时加热，受热均匀，可使反应充分，从而提取率较高，是一种快速、高效、节能且实用的新型工艺[16-17]。本研究实验结果表明，微波消解法以最佳工艺提取总黄酮的得率为1.25%，与传统工艺相比，微波消解法提取柚皮总黄酮不仅节约提取时间，且提取率较高，此法对于扩大工业化生产具有一定的现实意义。与现有的微波消解法提取黄酮文献研究相比，本研究中微波消解法下柚皮总黄酮的提取率较高，可能是因为沙田柚原产地广西容县所产的柚皮黄酮类成分较高。

纤维素酶辅助法是运用酶反应的高度专一性，从而对细胞壁进行破坏，使胞内黄酮化合物溶出。提高该方法提取率的关键在与如何控制好适合酶解温度及酸碱度。由本实验得该法在pH 5.0、加入4 mg/g的纤维素酶在50 ℃下提取35 min所得的提取率最高，为1.10%，相对于微波消解法较低，原因为受热均匀程度不及微波加热，且纤维酶活性较低，反应条件较难控制，制约了提取效率，且纤维素酶在实验成本中相对较高，因此选择微波消解法优于纤维酶辅助法。

超声提取法利用超声波的空化作用，产生振动加速柚皮胞内黄酮的释放，该法适用范围广泛，且无需特殊装置，操作简单，快速高效，与传统的提取方法如冷浸法、回流法相比在时间上有所缩短。但在此次试验中，最佳提取条件在提取温度60 ℃、提取时间50 min、料液比1:25(g:mL)，此条件下柚皮总黄酮提取率为1.04%，提取时间比前两种方法都较长，且提取效率不及前两者高，考虑提取效率的情况下更推荐使用微波消解法。

本研究以广西容县沙田柚柚皮为原料，比较了超声法、纤维素酶辅助法、微波消解法下柚皮总黄酮的提取率，得出最佳提取方法及工艺路线，即以料液比1:20(g:mL)、乙醇浓度85%，提取温度70 ℃、提取时间10 min为条件进行微波消解法提取，该方法简单、快速、高效，可为柚皮总黄酮类化合物在食品工业和医药工业的提取和应用提供参考依据。