探讨芪葵颗粒干预2 型糖尿病合并骨质疏松大鼠的实验研究*

娄 妍，余 旭，孙心怡，缪鋆鋆，徐巍龙，查 敏

江苏省中医院/南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029

研究[1］表明，2 型糖尿病患者近20%合并骨质疏松，由于该类患者普遍合并神经病变等高风险因素，加之骨组织纤维结构的改变，骨骼脆性增加，骨折的发病风险较正常人群显著增高。2 型糖尿病合并骨质疏松患者最常发生骨折的部位为胸腰椎、桡骨远端、足踝和髋关节，均为人体负重结构，一旦发生骨折则将较长时间丧失劳动能力。此外，该类患者常存在手术切口不愈合、感染等并发症，给临床治疗带来难题。芪葵颗粒是南京中医药大学附属医院院内制剂。本研究拟通过动物实验，探究芪葵颗粒对2 型糖尿病合并骨质疏松大鼠糖脂代谢指标的干预作用，同时探究芪葵颗粒对大鼠MSCs 分化的诱导方向，以期为临床治疗2型糖尿病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物雌性SD大鼠18只，体质量200～250 g，12周龄，购于南京青龙山实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK-2019-0106。饲养于南京中医药大学动物实验中心，饲养条件：清洁级。本研究由南京中医药大学附属医院动物伦理委员会批准。

1.2 药品及试剂芪葵颗粒由江苏省中医院药房提供。链尿佐菌素（Biosharp 公司，批号：BS185）；地塞米松磷酸钠注射液（湖北药业有限公司，批号：50-02-2，规格：5 mg/支）；青霉素G（利康药业，批号：61-33-6，规格：80 万U/支）；庆大霉素（利康药业，批号：1403-66-3，规格：8 万U/支）；胎牛血清（Gibco，规格：500 mL/瓶）；L-DMEM 培养基（Cyagen公司）；SD大鼠BMSC成骨诱导培养基及成脂诱导培养基（Cyagen 公司）；苏木素、伊红（四季青公司）；茜素红、油红O 染液、噻唑蓝、DMSO、Percoll、BGP 及B-ALP 试剂盒（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 实验仪器37XC 型倒置相差显微镜（上海光学仪器厂）；JB-P5 型石蜡包埋及脱水机（武汉俊杰电子公司）；RM2016 型石蜡超薄切片机（武汉俊杰电子公司）；Image-pro plus 6.0（IPP）；恒温恒湿孵育箱（Heraeus）。

1.4 实验方法

1.4.1 造模及分组 将18只雌性SD大鼠随机分为假造模组、模型对照组及治疗组，每组6 只。假造模组进行假手术并注射等量生理盐水。模型对照组及治疗组使用卵巢切除术+链尿佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法进行造模。空腹血糖＞16.7 mmol/L，默认为造模成功。

1.4.2 干预方法 芪葵颗粒灌胃剂型制备方法：芪葵颗粒根据实验动物与人按体表面积等效量换算比率计算给药剂量为：2.7 g/kg。治疗组造模后每日予芪葵颗粒，假造模组、模型对照组给予等量生理盐水，共干预3周。

1.5 观察指标

1.5.1 血糖、血脂、体质量及骨密度测定 造模及干预完成后，测定各组大鼠血糖（glucose，Glu）、体质量（body weight，BW）、甘油三酯（triglyceride，TG）、骨密度（bone mineral density，BMD）值。

1.5.2 间充质干细胞的提取和培养 将各组大鼠股骨近端髓腔直接在无菌条件下放于L-DMEM培养基中冲洗，冲出的骨髓细胞悬液离心半径30 cm，1000 r/min 离心10 min，弃上清、脂肪及杂质，加入少量DMEM 重悬，沿离心管壁缓慢滴入含等量体积的Percoll（密度为1.073 g/mL）分离液中，离心半径30 cm，1500 r/min 离心10 min。取中间云雾状细胞层置于另一离心管中，PBS冲洗2次后把得到的有核细胞进行培养，换液3 次后MSCs 则得以纯化。采用配制而成的L-DMEM 培养基（含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素），将纯化的MSCs以1×104/cm2的浓度接种于该培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3天换液1 次，细胞达90%融合后以0.25%胰蛋白酶消化，各组传代前冻存部分原代细胞备用。

1.5.3 茜素红染色钙矿化结节计数 使用成骨诱导培养基对各组MSCs 进行培养，诱导18 天，以Tris-Hcl 配制茜素红溶液至pH 4.0 染色30 min，200倍镜下随机选取6个视野，对红染钙矿化结节进行计数。

1.5.4 油红O染色脂肪细胞计数 使用成脂诱导培养基对各组传代一次的MSCs 进行成脂诱导12天。油红O 染液浸染30 min，苏木素染液浸染1 min，200 倍镜下随机选取6 个视野，对红染脂肪细胞进行计数。

1.5.5 BGP及B-ALP定量 各组MSCs按1×104/孔接种在36孔板上，每组6孔，成骨诱导培养基培养2周，使用B-ALP ELASA试剂盒进行检测，将各组上清吸取约50 μL，加入样本孔，而后加入HRP100 μL，37℃孵育60 min，弃去液体，拍干，洗涤液洗涤，反复5次。每孔加入底物50 μL，37℃避光孵育15 min，每孔加入终止液KOH 50 μL，酶联免疫监测仪测各孔450 nm波长的OD值。

1.5.6 MTT测定吸光度值 取各组BMSCs0.25%胰蛋白酶消化，以5×103/孔接种于96 孔板后移入37℃、5%CO2、饱和湿度标准培养箱中连续培养10天，分别于第1、3、5、7、10天加入MTT（5 g/L）20 μL/孔，4 h 后每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，于酶标仪450 nm 波长测定各孔吸光度值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.6 统计学方法实验数据均使用SPSS 22.0软件进行统计处理，计量资料用xˉ±s表示，采用重复测量数据的方差分析，LSD 法进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血糖、血脂、体质量及骨密度与模型对照组比较，治疗组血糖降低、骨密度增高（P＜0.05）；体质量、甘油三酯两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血糖、血脂、体质量及骨密度比较（xˉ±s）

2.2 钙结节及脂肪结节计数治疗组与假造模组茜素红染色均可见大量矿化的钙结节，两组钙结节数目比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示骨新生活跃。而模型对照组矿化钙结节数目较少，与其他两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗组及假造模组均可见少量红染脂肪细胞，数目比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而模型对照组脂肪细胞数显著多于其他两组（P＜0.05）。见图1、表1。

表1 各组大鼠钙结节及脂肪结节计数比较（xˉ±s） 个/HP

2.3 BGP 及B-ALP 定量各组BMCSs 成骨诱导后，模型对照组BGP及B-ALP含量均显著低于假造模组（P＜0.05），而芪葵颗粒组的BGP及B-ALP水平显著提高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 MTT 测定以假造模组为参照，模型对照组各时间段OD450 比值均显著降低（P＜0.05），治疗组OD450 比值均显著较模型组提高（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

在本研究中，造模后大鼠与假造模组相比，呈现典型的糖脂紊乱现象及显著的骨质疏松表现，表现为血糖升高，体质量增加，同时骨密度显著降低。给予芪葵颗粒干预后，模型大鼠的血糖显著降低，骨密度显著升高，体质量及甘油三酯未见明显改善，可能与研究干预周期较短有关。为进一步明确芪葵颗粒干预2 型糖尿病合并骨质疏松的效用机理，我们对各组大鼠股骨髓腔MSCs 进行了培养及成骨成脂诱导分化，结果显示，芪葵颗粒能显著诱导MSCs 向成骨方向分化，促进钙结节形成，同时降低MSCs 向脂肪方向分化，干预MSCs 的效应明显。同时，通过ELISA 研究证实，芪葵颗粒能显著提高成骨诱导关键蛋白BGP 及B-ALP 表达水平。此外，MTT 实验证实芪葵颗粒还能显著提高MSCs的传代和增殖活性，保持细胞干性。

流行病学研究显示，糖尿病患者较健康人群同年龄段合并骨质疏松的比例显著增高[2］。研究[3］发现，随着2 型糖尿病患者病程的延长，骨折的发生风险将增加1.7～2.2 倍。医学界认为，糖尿病微血管病变可使各处骨小梁出现微血管循环障碍，产生缺血缺氧病理改变，致使骨密度降低导致骨质疏松[4］。除较为宏观的血运因素外，代谢组学方面的改变也在2 型糖尿病患者并发骨质疏松过程中发挥了重要作用，高糖高渗透压可导致糖基化终末产物增加[5］，而糖基化终末产物的不断蓄积被证实可抑制MSCs 向成骨细胞的分化，并诱导成骨细胞凋亡和破骨细胞形成，导致骨质疏松发生[6］。因此，改善MSCs细胞分化，有助于干预2型糖尿病并发的骨质疏松。

芪葵颗粒主方由生黄芪、制首乌和黄蜀葵花等中药组成[7］，是江苏省中医院经典制剂，长期用于2 型糖尿病的早期干预和并发症的治疗。方中黄芪甘温、补中益气、升阳止渴、利水消肿[8-9］；制首乌补血养精、滋补肝肾、补虚而不滋腻[10］，二药配用，补益先天之本与后天之本，调气补血并重；配以黄蜀葵花，活血利尿消肿，补泻同施，标本兼顾[11］。基于网络药理学图谱，方剂的主要效用成分超过20 种，包括金丝桃苷、槲皮素、黄芪甲苷、二苯乙烯苷等。其中金丝桃苷及槲皮素具有显著的抗骨质疏松作用[12］。

综上所述，本研究初步证实，芪葵颗粒除能显著改善2 型糖尿病血糖指标外，还能有效干预糖尿病性骨质疏松，具有良好的临床应用前景和进一步深入研究的价值。