基于白细胞介素13/信号传导和转录激活因子6信号通路研究甘草酸二铵对慢性阻塞性肺疾病大鼠气管黏液高分泌的影响

赵娜，殷莉，秦晓楠

作者单位：河南省直第三人民医院呼吸内科，河南 郑州 450000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo‑nary disease，COPD）病因是气流受限不完全可逆并逐渐发展，与肺部对外界有害环境的异常炎症反应有关，其严重时会引起全身（或肺外）的不良效应［1］。由炎性细胞浸润表层上皮、黏液分泌腺增大和杯状细胞增多而导致的气管黏液高分泌是COPD 重要病理生理特征之一，与COPD 的发生、发展、临床结果密 切 相 关［2-3］。其 中，黏 蛋 白5AC（Mucin5AC，MUC5AC）是气管中最主要的分泌型黏蛋白，其表达水平代表着气管黏液分泌的强度。此外，有报道显示，细胞因子白细胞介素-13（IL-13）及其介导的信号转导和转录激活因子6（STAT6）信号转导通路与哮喘病人气管的黏液高分泌密切相关，可以显著诱导气管上皮杯状细胞的化生和MUC5AC 的表达［4］。甘草具有补脾益气、润肺止咳、缓急止痛的功效，而甘草酸二铵是中药甘草中的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节的作用。研究显示，服用甘草酸二铵的COPD 病人肺功能明显加强，肺部炎性水平明显降低［5］。但其作用机制研究较少，因此，2019年6月至2020年2月，本研究主要通过观察甘草酸二铵对香烟烟熏联合脂多糖（LPS）诱导的COPD 大鼠模型气管黏液高分泌的影响以及可能作用机制，以期为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料健康雄性SD大鼠100只，清洁级，8周龄体质量为（240±20）g，由珠海百试通生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（粤）2020-0051。本研究符合一般动物实验伦理学原则。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，温度为25 ℃，湿度为60%，实验室适应性饲养1周后用于实验研究。甘草酸二铵注射液（20190520），来自江苏神龙药业有限公司；注射用盐酸氨溴索（20190312），由山东罗欣药业集团股份有限公司生产。大鼠IL-13 ELISA 试剂盒来自上海江莱生物；实时定量荧光PCR（qRT-PCR）扩增引物由金唯智公司合成；TRIzol 试剂（货号为15596026）来自Invitrogen 公司；逆转录（货号为R123-01）及qRT-PCR 试剂盒（货号为Q121-02）来自南京诺唯赞公司；Western blotting 所用抗体均来自abcam 公司，一抗为兔抗IL-13 抗体（ab52538）、兔抗磷酸化的信号转导和转录激活因子6（p-STAT6）抗体（ab44718）、兔抗STAT6 抗体（ab217998）和兔抗MUC5AC 抗体（ab3649），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（ab205718）。

1.2 方法

1.2.1动物分组及建模 按随机数字表法将大鼠分为正常组，模型组，甘草酸二铵低、中、高剂量组和盐酸氨溴索组，每组15 只。COPD 大鼠模型制作参考王骏等［6］。除正常组外，其余各组在实验开始后的第1 天和第14 天将大鼠麻醉后气管内滴入200µg LPS；第2～13 天和第15～28 天在特制的1 m3的特制烟室中，给予大鼠每日2 次香烟烟熏（每次10 根，每次30 min）。第29～42 天，对各组大鼠进行相应的药物处理，均行大鼠尾部静脉注射。根据等效剂量折算表，大鼠对于甘草酸二铵注射液的等效剂量为15 mg/kg，因此，设置低、中、高剂量分别为7.5 mg/kg、15 mg/kg 和30 mg/kg。盐酸氨溴索组每日注射6.5 mg/kg。正常组和模型组大鼠注射等量无菌生理盐水。每天1次，持续14 d。

1.2.2酚红排痰实验 参考文献［7］研究，每组取5只大鼠，先将酚红用生理盐水配成不同浓度的溶液，分别测量其在558 nm 处的吸光度值，以此制作标准曲线，然后大鼠腹腔注射7.05 mmol/L 酚红溶液0.5 mL，30 min后处死分离气管，用1 mol/L氢氧化钠溶液反复冲洗，合并冲洗液注入比色管中，测量其在558 nm 处的吸光度值，根据酚红的标准曲线计算出痰液排泄量。

1.2.3大鼠肺功能检测 各组剩余10 只大鼠戊巴比妥钠注射麻醉后分离暴露气管，进行气管插管并固定，用小动物肺功能检测仪测定肺阻力（RI）和动态肺顺应性（Cdyn）。

1.2.4肺泡灌洗液中IL-13 的含量测定“1.2.3”中各组10 只大鼠检测肺功能后，行右支气管插管，用1 mL PBS反复抽吸3遍，回收肺泡灌洗液，回收率在80%以上，4 ℃、3 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保留备检；依照ELISA 试剂盒说明书步骤检测肺泡灌洗液中IL-13 的含量，酶标仪450 nm 检测待测样本，然后将样本的吸光度值代入回归方程，得到浓度值。

1.2.5大鼠肺组织病理学观察 各组10 只大鼠灌洗结束后，开胸，留取肺组织。肺组织固定于4%多聚甲醛中，常规操作制备石蜡切片并进行HE 染色，观察其病理学改变。

1.2.6实时荧光定量PCR 检测IL-13、STAT6 和MUC5AC mRNA表达量水平 取“1.2.5”所取左肺组织一小块，液氮速冻后采用TRIzol 等试剂提取肺组织总RNA，5 00 ng 定量逆转录合成cDNA，然后用SYBR Green Ⅰ荧光染料技术进行qRT-PCR 扩增。所用引物如表1 所示，反应条件为预变性95 ℃、5 min；循环反应95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，主循环40 个；融解曲线，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。采用2-ΔΔCt法，通过Ct值计算目的基因相对表达水平。

表1 实时定量荧光PCR引物序列

1.2.7肺 组 织IL-13、p-STAT6、MUC5AC 蛋 白 检测 取“1.2.5”中所保存各组肺组织，剪碎，置于玻璃匀浆器中；加入含有PMSF 的裂解液，冰上反复匀浆。30 min 后，4 ℃下12 000 r/min 离心5 min，收集上清液，参照BCA 试剂盒测定蛋白总浓度。配制10%分离胶、4%浓缩胶。取50 µg 蛋白上样，沸水浴处理5 min 使蛋白变性，冷却后可以上样。初始电压为80 V，待样品进入分离胶后，换成120 V。电泳结束后，将目的条带凝胶切除，转移到硝酸纤维素膜上，冰上进行转膜反应，电压为60 V，反应时间2 h。结束后用TBS 清洗，用封闭液室温下摇床摇动封 闭1 h，TBS 清 洗 后，加 入 兔 抗IL-13、兔 抗p-STAT6、兔抗STAT6 以及兔抗MUC5AC 单克隆抗体（稀释倍数1∶200），4 ℃过夜。TBS 后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗（稀释倍数1∶1 000），室温下孵育2 h，TBS 清洗、ECL 显色后置于BioRad成像系统中分析电泳条带。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件分析处理数据，计量资料均以xˉ±s描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草酸二铵对各组大鼠酚红排泌量和肺泡灌洗液中IL-13水平的影响与正常组相比，模型组气管排泌量和肺泡灌洗液中IL-13水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，甘草酸二铵各剂量组和盐酸氨溴索组大鼠气管排泌量和肺泡灌洗液中IL-13水平均显著降低（P<0.05）；其中甘草酸二铵高剂量组与盐酸氨溴索组气管排泌量差异无统计学意义（P>0.05），肺泡灌洗液中IL-13水平差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 甘草酸二铵对各组大鼠酚红排泌量的影响/±s

表2 甘草酸二铵对各组大鼠酚红排泌量的影响/±s

注：IL-13为白细胞介素-13。①与正常组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。③与甘草酸二铵低剂量组相比，P<0.05。④与甘草酸二铵中剂量组相比，P<0.05。⑤与甘草酸二铵高剂量组相比，P<0.05。

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2.2 甘草酸二铵对各组大鼠肺功能的影响与正常组相比，模型组大鼠RI 显著增高，Cdyn 显著降低（P<0.05）；与模型组相比，甘草酸二铵低、中、高剂量组RI 依次降低（P<0.05），Cdyn 依次增加（P<0.05），且甘草酸二铵高剂量组RI、Cdyn水平与盐酸氨溴索组差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 甘草酸二铵对各组大鼠肺功能的影响/（cmH2O·mL-1·s-1，±s）

表3 甘草酸二铵对各组大鼠肺功能的影响/（cmH2O·mL-1·s-1，±s）

注：RI为肺阻力，Cdyn为动态肺顺应性。①与正常组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。③与甘草酸二铵低剂量组相比，P<0.05。④与甘草酸二铵中剂量组相比，P<0.05。

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2.3 甘草酸二铵对大鼠肺组织病理学的影响正常组大鼠气管壁可见少量炎性细胞，肺形态正常，而模型组的大鼠表现出明显的支气管上皮炎性细胞浸润，随后小支气管壁增厚，支气管周围肺组织中的淋巴聚集体增加，支气管腔分泌物增多。与模型组相比，甘草酸二铵低、中、高剂量组都表现出较少的病理变化，尤其是甘草酸二铵高剂量组的大鼠，支气管无明显炎性细胞浸润和淋巴聚集，与盐酸氨溴索组类似。见图1。

图1 各组肺组织病理切片（HE染色×40）：A为正常组；B为模型组；C为甘草酸二铵7.5 mg/kg组；D为甘草酸二铵15 mg/kg组；E为甘草酸二铵30 mg/kg组；F为盐酸氨溴索组

2.4 甘草酸二铵对各组大鼠肺组织IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA 表达量的影响与正常组相比，模型组大鼠肺组织中IL-13、STAT6 和MUC5AC mRNA 表达水平显著增加（P<0.05）；与模型组比较，甘草酸二铵各剂量组大鼠肺组织中IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA 表达水平均显著减少（P<0.05），且呈剂量依赖性；与盐酸氨溴索组相比，甘草酸二铵高剂量组在IL-13、STAT6 表达量水平明显下降，而在MUC5AC mRNA水平无统计学意义，见表4。

表4 甘草酸二铵对各组大鼠肺组织IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA表达量的影响/±s

表4 甘草酸二铵对各组大鼠肺组织IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA表达量的影响/±s

注：IL-13为白细胞介素-13，STAT6为信号转导和转录激活因子6，MUC5AC为黏蛋白5AC，β-actin为β-肌动蛋白。①与正常组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。③与甘草酸二铵低剂量组相比，P<0.05。④与甘草酸二铵中剂量组相比，P<0.05。⑤与甘草酸二铵高剂量组相比，P<0.05。

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2.5 甘草酸二铵对各组大鼠肺组织IL-13/STAT6通路相关蛋白表达量的影响与正常组比较，模型组大鼠肺组织中IL-13、p-STAT6/STAT6 和MUC5AC蛋白表达水平均显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，甘草酸二铵各剂量组大鼠肺组织中IL-13、pSTAT-6/ STAT6 和MUC5AC 水平均显著下调，差异有统计学意义（P<0.05），且呈剂量依赖性，且甘草酸二铵高剂量组与盐酸氨溴索组IL-13、p-STAT6/STAT6 和MUC5AC 水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2，表5。

表5 甘草酸二铵对各组大鼠肺组织IL-13、p-STAT6和MUC5AC 蛋白表达量的影响/±s

表5 甘草酸二铵对各组大鼠肺组织IL-13、p-STAT6和MUC5AC 蛋白表达量的影响/±s

注：IL-13 为白细胞介素-13，p-STAT6 为磷酸化的信号转导和转录激活因子6，STAT6 为信号转导和转录激活因子6，MUC5AC 为黏蛋白5AC，β-actin为β-肌动蛋白。①与正常组相比，P<0.05。②与模型组相比，P<0.05。③与甘草酸二铵低剂量组相比，P<0.05。④与甘草酸二铵中剂量组相比，P<0.05。

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图2 甘草酸二铵对各组大鼠肺组织IL-13/STAT6通路相关蛋白表达量的影响

3 讨论

COPD 是呼吸内科常见疾病，容易引起并发症。最新调查显示，COPD 死亡率在全球疾病中排名第6，在我国排名第4，严重威胁着人们健康［8］。气管黏液分泌过多，一方面加重气管阻塞，引起通气功能障碍，加速肺功能下降；另一方面影响气管纤毛去除功能，从而影响COPD 病人对吸入细菌和有毒颗粒的去除，引起反复感染，并进一步刺激黏液分泌［9-10］。在本研究中，通过香烟烟熏联合LPS 建立COPD 大鼠模型，结果发现模型组大鼠相比正常组肺阻力增加，肺顺应性以及排痰能力均有下降，IL-13 在水平升高，STAT6 磷酸化水平以及MUC5AC mRNA和蛋白水平均增加，肺组织出现病理性损伤，说明COPD大鼠模型建立成功。

现代药理学认为，甘草酸二铵具有许多生物学功能，例如抗氧化，免疫调节，抗炎，调节内源性类固醇激素水平和保护细胞膜结构等［11］。研究表明，甘草酸二铵可以迅速作用于肺，通过改善肺血液循环，减少气管痉挛，增加肺泡通气，缓解临床症状［12］。另一方面，方妮等［13］发现COPD 稳定期病人应用甘草酸二铵后，较对照组血清CRP、IL-6 和TNF-α 水平明显降低，外周血T 淋巴细胞水平明显升高，说明甘草酸二铵可减轻炎症反应，增强免疫功能。甘草酸二铵对COPD 气管黏液高分泌的作用机制还不清楚，因此，本实验选用甘草酸二铵低、中、高三个剂量对COPD 大鼠模型进行处理，探究其对气管黏液高分泌的影响，并分析可能存在的作用机制。甘草酸二铵各剂量组大鼠较模型组相比均表现出肺泡灌洗液IL-13 降低，肺组织病理损伤减轻，提示甘草酸二铵改善COPD 大鼠气管黏液高分泌，与盐酸氨溴索处理组效果一致。

研究表明，气管黏液的分泌受体内多个信号通路调节［14］。其中，IL-13介导的信号通路在其中具有重要的调控作用。IL-13 对气管上皮杯状细胞的化生、黏蛋白的转录、翻译以及释放等黏液分泌的过程中都发挥着促进作用［15］。当用含有IL-13 的培养液培养人支气管上皮细胞时，可观察到上皮细胞转化为胞内富含黏液的杯状细胞［16］。而激活型转录因子STAT6 作为IL-13 信号通路的下游分子，在IL-13信号转导途径中发挥着极重要的作用［17］，当通过转基因技术使小鼠过表达IL-13 时，如果STAT6 信号通路完整，可以在大鼠体内无气管炎症的情况下观察到气管黏液高分泌的现象，说明IL-13 诱导小鼠气管上皮细胞黏液高分泌依赖于STAT6 信号通路［18］。MUC5AC 是构成COPD 病人黏液的主要黏蛋白，其基因转录水平可受STAT6 磷酸化水平调节。同时，有报道指出，IL-13 可增强MUC5AC 启动子活性，驱动MUC5AC 基因表达［19］。本研究中发现，甘草酸二铵各剂量组大鼠肺组织中IL-13、STAT6、MUC5AC mRNA 水平以及IL-13、p-STAT6/STAT6、MUC5AC蛋白表达水平都显著低于模型组，且呈剂量依赖性，进一步表明甘草酸二铵可能通过抑制IL-13/STAT6通路激活发挥降低慢性阻塞性肺疾病大鼠气管黏液高分泌的作用。

综上所述，甘草酸二铵抑制IL13/STAT6 信号通路，进而抑制黏液高分泌，改善气管阻塞，为临床治疗COPD 提供了新思路。然而未能说明甘草酸二铵与盐酸氨溴索各自的优缺点，还需进一步地研究。