Keggin型多金属氧簇抑制宫颈癌细胞生长的作用及其机制

董南南，陈瑞娇，史利霞，王艺璇，张韶华，王赞宏

(1 山西医科大学第三医院，山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院妇产科，太原 030032；2 山西医科大学第三医院，山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院妇产科；*通讯作者,E-mail:wangzanhong@126.com)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，最新数据显示目前每年仍有50万女性死于宫颈癌。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌及其癌前病变的最主要病因，约有99.8%的宫颈癌合并HPV感染[1,2]。HPV是双链DNA病毒，病毒DNA以整合形式存在于宿主细胞，通过癌蛋白发挥致癌作用，其中E6、E7基因分别编码含150个氨基酸和100个氨基酸的病毒癌蛋白，是HPV介导宫颈癌发生发展的重要分子[3]。多金属氧簇(polyoxometalates，POMs)是一类由过渡元素组成的原子团簇，主要包括Keggin、Anderson和Dawson3种结构，多金属氧簇等一系列化合物都可以由上述基本的结构骨架衍生而出，目前由于其亚纳米尺度、表面多负电荷、良好的生物相容性、分子可设计等特性使其在病毒、癌症防治中的研究呈活跃态势[4,5]。例如其中最具有代表性的杂多化合物HPA-23，不仅对HIV逆转录酶具有明确的抑制作用[6]，还可显著抑制肿瘤的活性[7]。近年来随着研究的深入，发现在POMs的多种结构中，Keggin结构的多金属氧酸盐抗肿瘤活性最强[8]。本研究通过设计合成新型Keggin型多金属氧簇mPEG-Si-POM，表征其结构，研究其对宫颈癌SiHa细胞的抑制作用及可能的作用机制，为探索宫颈癌的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

IMPACT 400 FTIR型红外光谱仪(美国NICOLET公司)；EFT-60/90核磁共振波谱(美国ANASAZI公司)；HF90型CO2恒温细胞培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；XDS1C型倒置生物显微镜(上海万衡精密仪器有限公司)；680型酶标仪(美国BIORAD公司)。

HPV16 E6、HPV16 E7鼠抗人单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗均购自美国Santa Cruz公司，monodansylcadaverin(MDC)购自美国Sigma Aldrich公司，细胞组织裂解液RIPA及蛋白酶抑制剂PMSF购自上海申能博彩公司，BCA蛋白定量试剂盒为美国PIERCE公司产品，DMEM培养基、胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品，宫颈癌细胞株SiHa(宫颈鳞癌，HPV16阳性)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，由本实验室保种。

1.2 实验方法

1.2.1 设计合成新型Keggin型多金属氧簇 以聚乙二醇单甲醚调节产物亲水疏水平衡值，通过端羟基的硅氧烷改性，使聚合物与Keggin型POMs通过-Si-O-共价键结合，制备聚乙二醇单甲醚杂化POM(mPEG-Si-POM)。

1.2.2 通过红外线、核磁共振对mPEG-Si-POM结构进行表征 采用傅立叶红外光谱仪对mPEG-Si-POM进行结构表征，观察mPEG-Si-POM吸收峰；采用核磁共振对mPEG-Si-POM进行结构表征，观察其合成状况。

1.2.3 SiHa细胞培养 将人宫颈癌细胞SiHa置于加入含有100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在5% CO2、37 ℃湿度饱和的培养箱中进行培养，至对数生长期进行实验。

1.2.4 MTT法测定mPEG-Si-POM对SiHa细胞增殖的影响 收集对数生长期的SiHa细胞，按1×105细胞/孔种植在96孔板培养24 h后，将SiHa细胞分为实验组和空白对照组，吸出培养液，实验组每孔加入的药物溶液200 μl(药物的终浓度为1，2，4，8，16，32，64，128 μmol/L)，空白对照组每孔加入200 μl的DMEM培养基。继续培养48 h，每孔加入20 μl 5 g/L MTT，继续温育4 h，加入100 μl DMSO，震摇15 min，酶联检测仪上测波长490 nm处吸光值(OD值)。每组重复3次，取平均值，计算每个浓度的细胞增殖抑制率：增殖抑制率=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%，IC50值通过改良寇式法得出：lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]，并通过拟合曲线函数进行验证，其中Xm指实验中最大药物剂量取对数，I指最大剂量与相邻剂量比值的对数值，P指阳性反应率之和，Pm指最大阳性反应率，Pn指最小阳性反应率。

1.2.5 Western blot检测HPV E6、E7蛋白表达的变化 经过预冷处理的PBS洗涤SiHa细胞两次，每孔细胞内加入1 μl PMSF和100 μl RIPA，收集细胞，冰上放置30 min，4 ℃ 14 000 r/min离心30 min，提取细胞总蛋白质，应用BCA法测定蛋白含量，取50 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入HPV16 E6、E7单克隆抗体(工作浓度均为1 ∶50)，4 ℃冰箱过夜，用含0.1%Tween20的TBST清洗3遍，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(工作浓度1 ∶10 000)，室温孵育1 h，充分洗膜后，加入发光底物显影液，曝光显影，在凝胶成像分析系统中成像并测量特异性条带的表达强度。每组重复检测3次。

1.2.6 MDC荧光染色检测自噬 自噬囊泡用MDC染色来进行[9]，MDC为荧光染料，被细胞吸收后，浓聚于自噬体，可显示自噬体的形成及数量。取对数生长期的SiHa，按1×106细胞/孔接种于药物浓度为0.05 mmol/L的MDC 6孔板，于37 ℃温育60 min后，胰酶消化制成单细胞悬液，4%多聚甲醛固定，PBS洗两次，使用荧光显微镜进行观察和摄片。

1.2.7 Hoechst 33258检测细胞凋亡 收集对数生长期的SiHa细胞，按1×106细胞/孔种植在24孔板，药物浓度为10.31 μmol/L的mPEG-Si-POM作用48 h后，吸尽培养液，4%中性甲醛固定液作用10 min，PBS液洗2次，吸净液体，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min，去除液体，PBS液洗2次，荧光显微镜下检测到呈蓝色的细胞核。计数300个以上细胞，以出现细胞体积缩小、细胞核固缩、染色质边集和凋亡小体形成判断为凋亡细胞，并计算凋亡指数(apoptosis index, AI)，AI=凋亡细胞数/(正常细胞+凋亡细胞)×100%。

2 结果

2.1 红外光谱表征mPEG-Si-POM

采用傅立叶红外光谱仪对mPEG-Si-POM进行结构表征，从图中可以看出mPEG-Si-POM在1 483，1 352，1 250，1 007，1 033，960，860，810，707 cm-1处有吸收峰(见图1)。

图1 mPEG-Si-POM的傅立叶红外光谱仪(FT-IR)谱图Figure 1 FT-IR spectra of mPEG-Si-POM

2.2 核磁共振波谱分析对mPEG-Si-POM进行结构表征

采用核磁共振对mPEG-Si-POM进行结构表征，mPEG-Si-POM的结构表征见图2。1H谱示分别在3.5×10-6，3.3×10-6，0.7×10-6，1.7×10-6处达到峰值，表示mPEG-Si-POM中4种不同位点的H原子，31P谱示在-13.8×10-6处达到峰值，29Si谱示在-50×10-6达到峰值(见图2)，说明mPEG-Si-POM已经成功合成。

A. 1H NMR图谱 B. 31P NMR图谱 C. 29Si NMR图谱1，2，3，4表示mPEG-Si-POM中4种不同位点的H原子图2 mPEG-Si-POM的核磁共振扫描谱图Figure 2 NMR spectra of mPEG-Si-POM

2.3 mPEG-Si-POM对SiHa细胞增殖的影响

以不同浓度mPEG-Si-POM作用于SiHa细胞，mPEG-Si-POM对SiHa细胞有明显的抑制作用。并且随着药物浓度的增加，抑制率也相应增大，具有药物浓度依赖性(F=76.236，P<0.001，见表1)。同时随着药物作用时间的增长，抑制率也逐渐增强(F=78.944，P<0.001，见表1)，提示mPEG-Si-POM具有明显的抗肿瘤活性，并呈时间依赖性。通过改良寇式法得出IC50值为(10.31 ±0.91)μmol/L，并通过拟合曲线函数(y=0.432 8x+0.063 2，R2=0.979 7)进行验证，即当药物浓度为10.31 μmol/L时，可诱导肿瘤细胞凋亡50%。

表1 mPEG-Si-POM对SiHa细胞的增殖抑制率Table 1 Proliferation inhibition rate of mPEG-Si-POM to SiHa cells

2.4 mPEG-Si-POM对SiHa细胞凋亡的影响

以10.31 μmol/L mPEG-Si-POM作用SiHa细胞后，可见各组中均出现细胞体积缩小、细胞核异型、细胞核固缩、染色质边集和凋亡小体形成的变化，空白对照组细胞的凋亡指数为(4.33 ±1.56)%，实验组细胞凋亡指数为(16.82 ±3.71)%，实验组凋亡指数明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

图3 mPEG-Si-POM作用SiHa细胞的凋亡指数 (×40)Figure 3 Effect of mPEG-Si-POM on apoptosis index of SiHa cells (×40)

2.5 mPEG-Si-POM对SiHa细胞自噬的影响

MDC为荧光染料，被细胞吸收后，浓聚于自噬体，可显示自噬体的形成及数量。以10.31 μmol/L mPEG-Si-POM作用SiHa细胞后，实验组细胞内自噬体形成显著增加(见图4)。

箭头所指为MDC荧光染色后的自噬体图4 mPEG-Si-POM对SiHa细胞的自噬的影响 (MDC，×400)Figure 4 Effect of mPEG-Si-POM on autophagy of SiHa cells (MDC,×400)

2.6 mPEG-Si-POM对HPV16 E6、E7蛋白表达的影响

以10.31 μmol/L mPEG-Si-POM作用SiHa细胞后，检查HPV16 E6、E7蛋白的表达，与对照组相比，实验组HPV16 E6、E7蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图5)。

与对照组比较，* P <0.05图5 Western blot检测mPEG-Si-POM对SiHa细胞的HPV16 E6、E7蛋白表达的影响Figure 5 Effects of mPEG-Si-POM on HPV16 E6 and E7 protein expression in SiHa cells by Western blot

3 讨论

宫颈癌是病毒感染性肿瘤，HPV感染是宫颈癌及其癌前病变的最主要病因。近年来随着HPV疫苗的逐步推广和宫颈癌筛查的广泛使用，使宫颈癌的一级预防和二级预防得以开展，但是其发病率依然居高不下，特别是晚期患者预后极差。HPV是双链DNA病毒，病毒DNA以整合形式存在于宿主细胞，通过癌蛋白发挥致癌作用。其中E6、E7癌蛋白对于恶性肿瘤的转归和维持起至关重要的作用，可以通过影响多种信号通路使细胞发生凋亡、侵袭等生物细胞行为[10]。

多金属氧簇(polyoxometalates，POMs)其基本骨架中心为XO4(X=Si，P，As，Ge，B)等四面体，外围是MO6八面体(M=Mo，W，V等)，主要包括Keggin、Anderson和Dawson 3种结构；另外按照所含主要金属原子分类，多金属氧酸盐主要包括钨系、钼系、锗系和钒系。近年来关于其的药物化学研究进展迅速，药理活性明确，在抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤等方面的研究活跃[8]。

在抗肿瘤方面，Dianat等[11]在研究中发现Keggin结构的POMs通过与ctDNA相互作用对乳腺癌细胞MCF-7、HEK-293细胞有明显的抑制作用。Wang等[12]研究发现含钴的POMs对人结肠癌HT-29细胞通过上调Caspase-3表达，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。随着研究的不断深入表明在基本结构方面Keggin结构的POMs抗肿瘤活性最强[13]；金属原子方面，随着钼原子被钨原子取代数量的增加，POMs的抗肿瘤活性逐渐降低，随着钼原子被钒原子取代数量的增加，多酸盐的抗肿瘤作用逐渐地增强[14]。Xue等[15]利用HPV衣壳蛋白L1和POM成功构建了生物无机组装[Mo154]，显著增强了抗肿瘤作用，为扩展[Mo154]作为一种抗肿瘤药物的生物应用奠定了基础。Ong等[16]合成的CoV-poms对正常细胞表现出无毒行为，同时还揭示了其对肺腺癌和乳腺腺癌的抗癌特性。围绕POMs这一抗肿瘤特性，本研究通过端羟基的硅氧烷改性，使聚合物与Keggin型POMs通过-Si-O-共价键结合，设计合成富含阴离子的mPEG-Si-POM，通过红外光谱及核磁共振波谱分析表征其结构，表明合成成功。以不同浓度mPEG-Si-POM作用于宫颈癌SiHa细胞，发现其对SiHa细胞有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性和时间依赖性，通过改良寇式法计算得出：IC50值为(10.31 ±0.91)μmol/L，并经拟合曲线函数进行验证。通过对作用细胞凋亡指数和自噬体的检测，发现mPEG-Si-POM可以促进SiHa细胞凋亡和自噬的增加，进而导致细胞死亡。此外我们采用Western blot的方法检测了mPEG-Si-POM作用后SiHa细胞中HPV16 E6和E7蛋白表达的变化，发现其表达显著降低，提示mPEG-Si-POM可能通过抑制HPV重要癌蛋白的表达发挥促进宫颈癌细胞死亡的作用。目前关于POMs的抗病毒作用也有报道，Yamamoto等[17]发现硅钨系POMs可以抑制与HIV相关的逆转录酶的活性，并可通过占据病毒包膜中与细胞表面相互作用的位点，抑制HIV与细胞的结合。Shigeta等[18]的研究提示，POMs通过其富含的负电荷可以抑制流感病毒包膜与细胞膜的融合，抑制流感病毒的感染。在HBV的研究中，POMs不仅可以抑制DNA复制和RNA转录，还可以抑制HBV抗原的分泌[19]。但是关于POMs在HPV方面的研究罕有报道，对于宫颈癌这一HPV依赖性肿瘤，深入研究POMs在抗HPV抗宫颈癌中的作用，可能会为宫颈癌的预防和治疗提供新思路。