茶树种子贮藏及提高活力方法研究

林瑾 郑鹏 陈玉春 刘少群 孙彬妹

摘要：茶树种子播种对农业生产有重大意义，而茶树种子保存对播种具有重要作用。茶树种子在通过品质检验、活性检测后，结合合理的贮藏方法可实现长期保存且仍具有较高的活力遗传性和发芽率。文章总结了有关茶树种子活力鉴定、贮藏特性、发芽率及其影响因素等方面的问题，探讨茶树种子品质检验标准、贮藏条件和贮藏方法，以期为今后茶树种子保存、繁育等有关研究工作提供理论参考。

关键词：茶树;种子;保存;活力;成活率

Study on Methods of Storage and Vigor

Enhancement of Tea Seeds

LIN Jin1， ZHENG Peng1， CHEN Yuchun2， LIU Shaoqun1， SUN Binmei1*

1. South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

2. Chaozhou Tianxia Tea Industry Co.， Ltd.， Chaozhou 521000， China

Abstract： Tea seed sowing is of great significance to agricultural production， while tea seed preservation plays an important role in sowing. After passing the quality test and activity detection， tea seeds combined with reasonable storage method can achieve long-term preservation and still have high vitality heritability and germination rate. This paper included the vitality identification， storage characteristics， germination rate and influencing factors of tea seeds， and discussed the quality inspection standards， storage conditions and storage methods of tea seeds， in order to provide a theoretical reference for the related research work of tea seed preservation and breeding in the future.

Keywords： tea plant， seed， storage， vigor， survival percent

茶樹种子对干燥脱水极为敏感，属于典型的顽拗型种子[1]。茶树种子含水率高达20%～60%，成熟茶树种子长时间干燥脱水时，其生命活力会迅速下降。目前，对茶树种子脱水方面的研究主要集中在生理生化和细胞学等领域[2]。Chen等[3]研究表明，对茶树种子进行材料的脱水处理，增强低温耐性后，仍能在接近0 ℃的低温下保存数月，也能在液氮中保存下来。但是茶树种子不耐脱水且易受低温影响，一般在未达到低温保存的理想状态时就因对低温的敏感性而失活。因此，降低茶树种子对低温的敏感性是当前研究长期保存茶树种子的重要工作之一。在超低温下，细胞物质代谢和生命活动几乎停止，在这个机制中，Normah等[4]曾采用液氮方法保存顽拗型种子，郭长根等[5]也在液氮中保存顽拗型茶树种子获得成功。这些试验证明液氮保存技术具有“无限期”保存顽拗型种子的可能，初步实现了长期保存茶树种子的预想。试验证明，在不同成熟阶段中，成熟中期的茶树种子最耐脱水，更易保存[6]。因此，在贮藏种子前，应选成熟中期的茶树种子，并进行品质检验。在贮藏茶树种子期间，应适时检测其活力以获取保存过程种子活力变化趋势。

1  茶树种子品质检验标准

茶树种子采收后，应先根据标准进行品质检验，挑选优质种子进行保存，亦可节省贮藏空间。茶树种子的品质标准为：夹杂物不超过2%、直径不小于12 mm、千粒质量不低于1 000 g、含水率在22%～38%之间、发芽率不低于75%[7]。

2  茶树种子活力检测方法

在贮藏之前，可采用茚三酮溶液显色法或TTc定量法（表1）测定茶树种子活力，通过检测活力来及时反映茶树种子在长期保存下遇到的问题，并做出合理改进。

茚三酮溶液显色法可定量检测种子浸提液的氨基酸含量[8]，徐祥美[9]通过测定氨基酸茚三酮溶液的吸收峰以及测试氨基酸与茚三酮形成的蓝紫色复合物的稳定性，来说明种子的氨基酸外渗量可反映出种子的品质及衰老程度。沈永等[10]也设计出价廉、快速、重现性好的茚三酮试纸法，该方法能够反映种子播种价值，并半定量检测种子活力。TTc定量法是测定种子脱氢酶活性快速而简便的方法，脱氢酶活性与种子活力密切相关，脱氢酶活性高则种子活力高[8]。胡晋[11]通过改进TTc定量法省去了研磨、定容、离心等过程，大大简化了操作步骤，并减少了三苯基甲臜（TTcH）的损失和氧化，提高了种子活力检测的精确度。

3  茶树种子贮藏特性

3.1  易受干燥损伤，对低温敏感、易发生冷害

干燥脱水会降低茶树种子细胞中水介质的流动性，产生代谢胁迫，细胞失去膨胀甚至发生萎缩，引起机械应力，阻碍细胞膜相对流动，进而降低脂肪酸的不饱和度。当茶树种子在-25 ℃及以下的环境中长时间保存，极易造成细胞因产生冰晶而对其结构造成破坏性损害[6]。40337452-CF39-4E08-A258-AE78B6224B83

3.2  微生物生长旺盛，呼吸作用强

顽拗型种子的临界水分大多在30%以上，为微生物的生长提供了充足的水分。当种子含水率增加、贮藏温度升高时，其代谢能力增强，呼吸作用也进而加强。

3.3  贮藏期间易发芽

在贮藏期间，种子在水分充足的情况下，易发芽。

4  茶树种子发芽率及其影响因素

4.1  茶树种子发芽率

种子在無任何贮藏措施的情况下，随着贮藏时间的延长，半年后发芽率会迅速下降到20%左右[12]。郭长根等[5]采用铝箔-薄膜复合袋密封包装，将含水率为13.8%的种子直接投入液氮中贮藏，经118 d贮存后发芽率仍高达93.3%[13]，证明在适宜的贮藏条件下，种子长时间贮藏仍有较高发芽率。

茶树种子发芽率可使用温砂法测定，任取茶树种子100粒，温水浸泡3～4 h后，放入铺有细沙的发芽盘中，上覆1层细沙，加少量水将沙湿润，在25～30 ℃温度下处理1～7 d，观察发芽茶树种子数量，计算发芽率。

4.2  形成茶树种子活力的内因

夏春华等[14]对茶树种子活力的研究结果表明，新鲜收获的茶树种子含有大量水分（约40%），茶树种子的贮藏物质主要有脂肪、蛋白质和淀粉（脂肪和淀粉为种子生命活动提供能量，而蛋白质决定新陈代谢类型和个体发育方向）。这些贮藏材料是保持种子活力的必要条件，也是保持种子活力的基础。种子活力是由多个基因控制的数量性状，近年来，种子活力相关基因的QTL定位及其遗传机制方面的研究取得较大进展，如已实现相关基因的克隆，马娟等[15]研究表明种子活力具有高遗传性等。在贮藏过程中，随着呼吸作用的加强，茶树种子贮藏物质逐渐消耗，造成种子活力降低，因此贮藏的前提便是抑制呼吸作用，保持种子的高活力。

4.3  茶树种子发芽条件

茶树种子发芽条件包括适宜的温度、充足的水分和氧气等。种子中有机和无机物质的分解需要酶的催化，酶需要在一定温度下进行催化;当种子的水分充足，种皮会软化和膨胀，进而氧气进入并加强呼吸;氧气充足时细胞的呼吸才会加强，酶的活动才会旺盛。

5  茶树种子贮藏条件

5.1  控制水分

控制水分有两种方式，一是使种子的含水率高于致死临界含水率，如短期贮藏方法——将去果皮的茶树种子用湿沙法贮藏2个多月[16]、吸胀贮藏、水浸贮藏;二是降低种子临界含水率，如超低温保存中快速脱水法——使茶树种子短时间内降低含水率，减少因水分胁迫造成的细胞损害。

5.2  适宜低温

短期贮藏：在-196 ℃液氮中保存。

一般贮藏温度：对种子进行材料处理后（干燥至水分含量10%以下）可在0～5 ℃条件下密封贮藏。

6  茶树种子贮藏方法

在短时间内播种或运输的茶树种子，可将其放置于阴凉干燥的室内，厚度不应超过15 cm，上方覆盖少许草料，每7～8 d翻动1次，使种子失水均匀。如需次年春季种植，应合理贮藏，以免影响发芽率[17]。有以下4种简单实用的茶树种子贮藏方法。

6.1  沙藏法

沙藏法适合小规模贮藏，属室内贮藏法。低温（5～7 ℃）沙藏，一定的含水率和含氧量维持正常生命活动的条件下，种子进入被迫休眠状态，但种皮的通透性增加，可提高种子的发芽率。

选通风干燥的室内，在地面铺1层5～10 cm厚含水率50%的细沙，上面铺10 cm厚的茶树种子，再铺5～10 cm厚含水率为50%的细沙，以此类推，堆高至30 cm即可。贮藏期间及时抽检与适量洒水，若茶树种子发生霉变应及时摊晾干燥。

6.2  沟藏法

沟藏法适合大规模茶树种子的贮藏，工程量大，属室外贮藏法。沟藏法在维持茶树种子所需的贮藏温度下，保证一定的湿度和二氧化碳浓度，以此减少自然损耗、抑制呼吸代谢、延长种子贮藏寿命。

在室外缓坡地，挖宽1 m、深30 cm的储藏沟，先在底部铺5～10 cm厚的蒲草或者细沙，倒入茶树种子，上面盖1层5～10 cm厚的蒲草，最后用泥土制作70 cm高屋脊形，间隔插入通气竹筒。其间需要及时检查种子是否发生霉变。

6.3  畦藏法

畦藏法适合大规模茶树种子的贮藏。

选择地势平坦、土壤干燥且排水条件好的地块做高畦，宽2 m、高18 cm，长度根据茶树种子的多少和地形的长短来确定。畦面做好后，铺1层2～3 cm厚的细沙，细沙上铺1层6～7 cm厚的茶树种子，茶树种子上再铺1薄层细沙，以茶树种子不露出沙面为度，如此相间重复铺完2～3层茶树种子后，再铺1层细沙，最后覆盖干土密封成龟背形[18]。

6.4  超低温保存

超低温-196 ℃液氮保存是将茶树种子自然干燥至含水率8%～10%，再以低温使其代谢降低，细胞、组织和器官在低温保存过程中不会发生遗传变异和性状变化。

每处理20粒种子后，用铝箔复合袋密封，直接放入液氮罐冷藏。2个月后取出，在38～40 ℃温水中迅速解冻恢复，然后用温沙法测定发芽率。

但是，如果生物体细胞内的水分在冷却过程中结冰，就会对细胞结构造成损伤和破坏，最终导致细胞死亡。因此，在液氮中保存（-196 ℃）以快冻快解的方法可以基本阻止水在顽拗型种子细胞内冻结，避免致命的冰冻伤害[19]，Song等[20]报道，快速降温至-30～-15 ℃短时间内保存可避免茶树种子内部细胞结构遭到损坏，因此，超低温保存中降温的速度是保持茶树种子活力的关键因素之一。

谈及低温冷冻保存，一般认为胚是最好的冷冻保存材料，因为胚是植物的雏形，包含了大部分的遗传信息。因此，大多数顽拗型种子都是在胚（或下胚轴）的成熟期时在超低温下贮藏，而且材料越新鲜，效果越好。郭长根等[5]用液氮保存茶树种子，并获得显著的效果。此外，添加冷冻保护剂可防止冷冻和脱水过程中种子细胞结构的破坏，减少胁迫相关的自由基调节的损害[21]。40337452-CF39-4E08-A258-AE78B6224B83

茶树种子的超低温长期保存，材料的处理和选择都至关重要，比如以降低冰晶损伤的玻璃化法，却因茶树种子个头大，不利于玻璃化所需的脱水速率，所以不适用于茶树种子保存。因此，在今后的科研工作中，应对茶树种子的最佳保存部位和保存方式进行探索分析。

7  结论与展望

我国茶树育种研究的重要内容之一是利用优异种质资源培育新品种[22]，其中最经济、安全和高效的种质资源保存方式是种子保存。种子的含水率和贮藏温度对种质资源保存的影响格外重要。目前生产上所采用的各种贮藏方式，还不是十分理想，未能达到最大限度保持种子生活力的目的，有不少茶树种子都在贮藏中失去活力，从而造成损失[23]。

因此，即使不少研究表明超低温贮藏即液氮贮藏法是有望长期保存茶树种子的方法，但也还需深度研究其他贮藏方法，比如气调法、隔水浸泡法等，开拓更多种子保存方法的研究，改善贮藏种子的条件，加强对保存种子的管理。

水分是种子萌发的关键触发因素，但种子感知水分的机制仍未解决。Dorone等[24]发现了一个未鉴定的拟南芥朊蛋白，命名为FLOE1，该蛋白在水合过程中发生相分离，使胚能够感知水分胁迫，可证明FLOE1缩合物的生物物理状态调节了其在体内抑制不利环境下种子萌发的生物学功能。因此，可以设想通过种子萌发试验，证明FLOE1在水分胁迫条件下可降低种子的萌发以长期保存种子。

我国很早就开始进行了茶树种质的组织培养，上个世纪已成功应用于农业、林业和医学类等相关领域，产生了巨大的经济效益和社会效益。将不同的品种进行诱导植株，不断地培养，从而形成科学稳定的系统，并能够在一般环境下很好地遗传，将这种方法应用于茶树种子的保护和储存，是目前发展的趋势[25]，该技术也在不断地创新优化中变得更加成熟。

茶树种子的贮藏包装方式方法，也是现如今应积极研究解决的问题。世界主要产茶国在茶树种子方面做了大量工作，并取得了一些成果，科研工作者更应汲取经验，研究开发茶树种子长期保存更有效的方法，提高我国农业科技进步水平。

参考文献

[1] 金孝芳. 茶树种子脱水敏感性机制及LEA蛋白的鉴定与表达分析[D]. 合肥： 安徽农业大学， 2019.

[2] 袁支红. 茶树种子脱水过程差异基因的研究[D]. 合肥： 安徽农业大学， 2008.

[3] CHEN H， PRITCHARD H W， SEAL C E， et al. Post desiccation germination of mature seeds of tea （Camellia sinensis L.） can be enhanced by pro-oxidant treatment， but partial desiccation tolerance does not ensure survival at -20 ℃[J]. Plant Science， 2012， 184： 36-44.

[4] NORMAH M N， CHIN H F， HOR Y L. Desiccation ang cryopreservation of embryonic axes of Hevea brasiliensis Muell.-Arg.[J]. Pertanika， 1986， 9（3）： 299-303.

[5] 郭長根， 胡晋， 楼锡元， 等. 茶籽的超低温（-196℃）贮藏[J]. 浙江农业大学学报， 1991（3）： 21-27.

[6] 宋丹萍， JAGANATHAN G K， 刘威， 等. 龙井茶茶树种质资源低温保存特性研究[J]. 上海理工大学学报， 2018， 40（5）： 481-488.

[7] 黄意欢. 茶学实验技术[M]. 北京： 中国农业出版社， 1997.

[8] 易官美， 徐祥美. 不同贮藏方法对庐山茶树种子活力影响的比较研究[J]. 种子， 2011， 30（3）： 7-9.

[9] 徐祥美. 用茚三酮溶液显色法测定种子浸提液氨基酸含量方法的探讨[J]. 种子， 1983（2）： 19-21， 4.

[10] 沈永， 林榕辉. 一种新的豆类种子活力快速测定法——茚三酮试纸法[J]. 种子， 1984（3）： 62-63.

[11] 胡晋. 对种子活力测定方法——TTC定量法的改进[J]. 种子， 1986（z1）： 73-74.

[12] 胥振国. 茶树种子在低温贮藏过程中差异基因表达的研究[D]. 合肥： 安徽农业大学， 2008.

[13] 晏嫦妤， 罗军武. 茶树种质资源的收集与保存研究进展[J]. 福建茶叶， 2006（2）： 13-15.

[14] 夏春华， 王月根， 朱全芬. 茶树种子生活力丧失的原因[J]. 茶叶科学， 1965， 2（4）： 50-56.

[15] 马娟， 王铁固， 余宁安， 等. 种子活力遗传和QTL定位研究进展[J]. 河南农业科学， 2010， 39（8）： 156-159.

[16] 杨广容， 邵宛芳， 陶梅， 等. 不同茶树品种种子萌发特性的研究[J]. 云南农业大学学报（自然科学）， 2013， 28（6）： 769-774.

[17] 雨声. 茶籽储藏方法[J]. 农村新技术， 2015（9）： 55.

[18] 江昌俊.茶树育种学[M]. 2版. 北京： 中国农业出版社， 2011.

[19] WALTERS C， BERJAK P，PAMMENTER N，et al. Plant science. Preservation of recalcitrant seeds[J]. Science， 2013， 339（6122）： 915-916.

[20] SONG D P， JAGANATHAN G K， HAN Y Y， et al. Camellia sinensis seeds are desiccation-tolerant but do not store well at sub-zero temperatures [J]. Seed Science and Technology， 2017， 45（3）： 714-719.

[21] 田新民， 李洪立， 何云， 等. 热带作物顽拗型种子保存研究进展[J]. 热带农业科学， 2014， 34（8）： 52-58.

[22] 金基强， 张晨禹， 马建强，等.茶树种质资源研究“十三五”进展及“十四五”发展方向[J]. 中国茶叶， 2021， 43（9）： 42-49， 76.

[23] 国营安徽宣郎广农场农业科学实验站. 茶小黄卷叶蛾发生的主要规律和防治经验[J]. 茶叶科学， 1965， 2（4）： 56-59.

[24] DORONE Y BOEYNAEMS S， FLORES E. A prion-like protein regulator of seed germination undergoes hydration-dependent phase separation[J]. Cell， 2021， 184（6）： 4284-4298.

[25] 陈泽锋. 广东茶树种质资源保存与利用现状[J]. 农家科技（下旬刊）， 2020（6）： 193.40337452-CF39-4E08-A258-AE78B6224B83