虎杖提取物对小鼠肝癌原位移植瘤及miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN 信号通路的影响

李泽山，刘超，申东方，顾小晖，何艳新

（郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450000）

0 引言

中药虎杖是以植物虎杖的根茎入药，其药理作用较多，具有“散淤镇痛、清热解毒”之功，其多重药用功效主要因其复杂的药物成分，已有研究发现，虎杖苷、白藜芦醇、大黄素及大黄甲素均是中药虎杖的有效药物成分[1-4]。原发性肝癌是消化系常见的恶性肿瘤，对血管依赖性极强，早期患者无明显症状，但即便早期仍可进行肝内血行性转移，其浸润和转移能力极强[5]。目前临床对早、中期肝癌主要以外科根治术并辅以放化疗进行治疗，但治疗效果并不理想[6]。中药是我国传统医学的瑰宝，采用现代科学方法积极探索传统中药的作用机制，探寻符合我国国情的治疗方法是中药研究的主要方向。虎杖苷提取物已被证实具有抗癌效果[7]，对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，但其对原发性肝癌的作用却鲜有报道。本团队应用不同浓度虎杖提取物，观察其对小鼠肝癌原位移植瘤的影响，并探索其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

雄性BALB/c小鼠，共40只，平均体重（19±1）g，周龄（5～6）周，均购自北京华阜康生物科技公司，动物许可证号：SCXK（京）2014-0004。饲养条件：昼夜比12:12，自由饮食，湿度35%～45%。小鼠H22肝癌细胞，购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 仪器及试剂

7900HT型Real-tim PCR仪（美国ABI公司）；DYCZ-40D型电泳仪+转膜槽（北京六一公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）；miRNA-204-5p荧光定量PCR试剂盒（北京六一公司，货号407106）；含有Jmj C域SMCX蛋白（Jarid2）、人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（英国Abcam公司，货号分别为ab184152、ab267787、ab9484）。

1.3 虎杖提取物制备

虎杖饮片购自我院中药房，将3kg虎杖饮片粉碎后过60目筛，参照欧水平等[8]提取方法进行，经乙醇回流、乙酸乙酯萃取、物质A保留、浓缩后硫酸回流、干燥、乙醚萃取、氢氧化钠萃取、物质B保留，保留物混合等步骤。虎杖提取物萃取率为10.33%。

1.4 H22肝癌细胞原位移植瘤模型制备

小鼠H22肝癌细胞原位移植瘤模型制备方法参考崔玮[9]等改进方法，即复苏H22细胞，调制细胞悬浊液，细胞密度1×106个/mL，将BALB/c小鼠麻醉后固定于鼠板，切开上腹部，轻压左肋部，左肝外叶。用25μL微量注射器吸取20μL细胞悬液，向左肝外叶缓缓注入。缝合，消毒，包扎，防止小鼠舔舐伤口造成感染。

1.5 分组及给药

将32只BALB/c小鼠肝癌细胞原位移植瘤模型制备成功，随机分为模型组、虎杖提取物低、中、高剂量组，每组8只，另取8只健康且同周龄小鼠作为对照组，虎杖提取物低、中、高剂量组小鼠分别给予虎杖提取物0.1mL、0.2mL及0.4mL配于适量体积的生理盐水中并灌胃，模型组及对照组给予与虎杖提取物低、中、高剂量组相同体积生理盐水灌胃，均连续处理28 d。

1.6 小鼠一般情况及脏器指数

记录各组小鼠实验前后存活率、体重及器官指数（肝脏指数、脾指数、胸腺指数）。存活率（%）=存活只数/本组总数×100%。器官指数（%）=器官重量/小鼠体重×100%。

1.7 抑瘤率检测

记录各组小鼠实验后平均瘤重及抑瘤率变化情况。瘤重：瘤体尽数剥离后重量。

抑瘤率（%）=[模型组平均瘤重（g）-虎杖提取物各剂量组平均瘤重（g）]/模型组平均瘤重（g）×100%

1.8 肝功指标影响

各组小鼠腹主动脉抽血后置于促凝管中，摇晃后待血液与管壁充分接触后静置2h，血清自行分离后抽取上层血清，采用ELISA法检测各组样本中丙氨酸氨基转移酶（ALT），天门冬氨酸氨基转移酶（AST），谷氨酰转移酶（GGT）的含量，操作过程由专业实验员进行，流程严格参照说明书进行。

1.9 瘤体miRNA-204-5p表达检测

将瘤体放入液氮中，进行冷研磨后进行总RNA提取，使用Real-tim PCR仪对肿瘤样本中miRNA-204-5p表达进行检测，检测流程严格参照miRNA-204-5p试剂盒说明书进行，检测相关试剂使用试剂盒自带分装试剂，2-ΔΔCt法计目标mRNA相对表达量。

1.10 Western blot检测瘤体Jarid2/PTEN信号通路表达

将各组肿瘤组织进行冷研磨后提取总蛋白并配置上样液。将各样本上样液加入10%分离胶缺口，进行常规SDS-PAGE电泳；将蓝色胶带于60V电压下转移至PVDF膜，并使用2mL脱脂牛奶拮抗多非特异性蛋白，封闭2h，PBS溶液水平摇床洗膜10min后，使用一抗（Jarid2、PTEN、GAPDH）封闭状态过夜；次日取出后常温下放置20min后进行洗膜去除多余一抗液体，常温下使用羊抗兔二抗进行孵育，1h后洗去二抗，加入ECL试剂放入暗盒中显影拍照。

1.11 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计，计量资料以（±s）表示，计数资料采用χ2检验，采用多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，多组间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠存活率、体重及脏器指数

对照组、模型组、虎杖提取物低、中、高剂量组存活只数分别为8、7、7、8、7只；存活率分别为100%、87.5%、87.5%、100%及87.5%，各组小鼠存活率无明显统计学差异（P>0.05）。与对照组比较，模型组体重及胸腺指数降低（P<0.05），肝脏指数及脾指数升高（P<0.05）；与模型组比较，虎杖提取物低、中、高剂量组体重及胸腺指数升高（P<0.05），肝脏指数及脾指数降低（P<0.05），且存在剂量依赖性（P<0.05），见表1。

表1 各组小鼠体重及脏器指数情况（±s）

表1 各组小鼠体重及脏器指数情况（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与虎杖提取物低剂量组比较，cP<0.05；与虎杖提取物中剂量组比较，dP<0.05

2.2 各组小鼠肝功能生化指标变化情况

与对照组比较，模型组血清ALT、AST及GGT含量均升高（P<0.05）；与模型组比较，虎杖提取物低、中、高剂量组上述指标均降低（P<0.05），且存在计量依赖性（P<0.05），见表2。

表2 各组小鼠肝功能生化指标情况（±s）

表2 各组小鼠肝功能生化指标情况（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与虎杖提取物低剂量组比较，cP<0.05；与虎杖提取物中剂量组比较，dP<0.05

2.3 各组小鼠瘤重及抑瘤率情况

与模型组比较，虎杖提取物低、中、高剂量组瘤重降低（P<0.05），抑瘤率升高（P<0.05），且存在剂量依赖性（P<0.05），见表3。

表3 各组小鼠瘤重及抑瘤率情况（±s）

表3 各组小鼠瘤重及抑瘤率情况（±s）

注：与模型组比较，bP<0.05；与虎杖提取物低剂量组比较，cP<0.05；与虎杖提取物中剂量组比较，dP<0.05

2.4 各组小鼠肿瘤组织中miRNA-204-5p表达情况

模型组、虎杖提取物低、中、高剂量组小鼠肿瘤组织中miRNA-204-5p相对表达量分为为（1.08±0.04）、（1.34±0.08）、（1.57±0.19）及（1.89±0.16）；与模型组比较，虎杖提取物低、中、高剂量组miRNA-204-5p表达升高（P<0.05），且呈剂量依赖性（P<0.05）。

2.5 各组小鼠肿瘤组织中Jarid2、PTEN表达情况

与模型组比较，虎杖提取物低、中、高剂量组小鼠肿瘤组织中Jarid2表达降低，PTEN表达升高，且呈量依赖性（P<0.05），见图1、表4。

表4 各组小鼠肿瘤组织中Jarid2、PTEN表达情况（/GAPDH，±s）

表4 各组小鼠肿瘤组织中Jarid2、PTEN表达情况（/GAPDH，±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与虎杖提取物低剂量组比较，cP<0.05；与虎杖提取物中剂量组比较，dP<0.05

图1 组小鼠肿瘤组织中Jarid2、PTEN表达电泳图

3 讨论

肿瘤防治是近几年医学研究的热点及主题之一，肝癌在肿瘤中具有治愈率低、复发性高、病死率高的特点[10]，寻找新的辅助治疗方法有可能是提高肝癌治愈率，改善患者生活质量的有效方法之一。中药虎杖近些年被证实与保护肝脏有关，虎杖中最为重要的中药单体虎杖苷是白藜芦醇与葡萄糖的结合产物，可改善休克大鼠肝细胞线粒体膜电位和线粒体通透性转换孔开方程度，减轻肝细胞线粒体损伤，保持肝细胞活性，从而保护肝脏功能[11]。另有研究显示[12]，虎杖苷可降低慢性肝硬化患者肝星状细胞活力，减少纤维化关键蛋白表达，从而抑制肝脏纤维化形成。刘嘉辉等[13]应用现代软件数据库对中药虎杖中17个主要成分与肝癌与PharmMapper数据库269个预测靶点的作用进行相互交集测定，证实中药虎杖提取物与肝癌细胞有35个潜在结合靶点，可有效抗击肝癌，这也是本研究选择探究虎杖提取物对肝癌原位移植瘤影响的理论之一。

本研究结束后首先对各组小鼠体重、脏器指数及血清肝功能指标进行检测，结果显示，肝癌原位移植瘤小鼠较健康小鼠体重及胸腺指数降低，肝脏指数、脾指数及肝功能指标ALT、AST、GGT血清含量升高。这表明肝癌原位肿瘤移植成功后，肿瘤其疯狂生长的特性吸取大量小鼠体内营养物质，增加肿瘤瘤体质量，致门静脉高压，脾功能亢进[15]，同时小鼠胸腺萎缩[14]，从整体说明肝癌原位移植瘤复制成功。而经虎杖提取物治疗后，小鼠血清肝功能指标ALT、AST、GGT含量及肝、脾指数降低，胸腺指数升高，且存在剂量依赖性，说明虎杖提取物可改善肝癌原位移植瘤小鼠肝功能及整体内脏状态，并且随剂量的增加而加强临床疗效。

在肿瘤动物模型中，瘤重及抑瘤率是药理学作用效果最直接的体现，尤其在肝癌实验中是必不可少的直接证据[16]。本研究结果显示，肝癌原位移植瘤小鼠经虎杖提取物治疗后，瘤重降低，抑瘤率升高，且存在剂量依赖性，说明高剂量虎杖提取物可最大限度地抑制肝癌细胞增殖，减缓肿瘤组织生长速度，是虎杖提取物可在整体动物实验层面抑制肝癌发展最直接的证据。

为了深入探究虎杖提取物抑制肝癌原位移植瘤生长，并改善小鼠整体状态的深层机制，本研究对各组小鼠肿瘤组织中miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN信号通路进行检测。miRNA-204-5p已被证实为抑癌调节基因，改善肿瘤微环境，可限制肿瘤细胞生长[17-18]。另有研究显示，Jarid2是miRNA-204-5p的下游蛋白，并且Jarid2蛋白在多种癌症的发展中均扮演关键角色，对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭均具有促进作用[19]，并且与葡萄膜黑色素瘤患者的低存活率相关，但在肝癌研究中尚鲜有报道[20]。PTEN蛋白在肿瘤细胞迁移和侵袭中起关键作用，受多种蛋白调节，其中包括Jarid2蛋白[21]。而本研究结果显示，虎杖提取物可有效提高肝癌原位移植瘤中抑癌调节基因miRNA-204-5p及PTEN表达，降低Jarid2蛋白表达，且存在剂量依赖性。这表明高浓度的虎杖提取物可能通过影响miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN信号通路表达，抑制肿瘤细胞生长，升高抑瘤率，达到改善抑制肝癌进展，减轻肝癌对周围组织压迫，改善内脏指数及肝功能的目的。

综上所述，虎杖提取物可有效抑制小鼠原位移植瘤生长，其机制可能与影响miRNA-204-5p/Jarid2/PTEN信号通路有关，值得进一步深入研究。