鸡矢藤水煎液对小鼠胶原诱导的关节炎的影响

符小鹏，曹林佳，王颖馨，章薇，王秋静，肖曼

(1.海南医学院2013级临床医学专业，海南 海口 571101；2.海南医学院基础医学与生命科学学院 生物化学与分子生物学教研室，海南 海口 571101)

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎症性疾病，其特点是关节滑膜的慢性炎症、软骨吸收、骨质破坏和骨质纤维化。类风湿性关节炎在各年龄中均可发病。临床尚未找到一种理想的药物能完全治愈此类疾病。目前普遍认为RA的炎症水平与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1、IL-1β、IL-6等表达相关，TNF-α、IL-1在机体的变态反应及自身免疫性疾病发病中的作用成为时下研究类风湿相关热点。鸡矢藤(Peaderia scandens)，别名牛皮冻，为茜草科鸡矢藤属植物，在海南有大量的生长与分布，鸡矢藤有消食祛风湿、活血消肿等功效。鸡矢藤应用涉及镇痛、抗炎、抗肿瘤等多方面，对疼痛、癌症、风湿性关节炎等多个病症具有防治作用。本实验采用Ⅱ型胶原蛋白诱导制备小鼠CIA模型，观察鸡矢藤对RA的防治作用，并进一步研究鸡矢藤对模型小鼠血清中的TNF-α和IL-1β的影响，以深入探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

选取60只5～6周龄的昆明种小鼠(由海南医学院实验动物中心提供)，随机均分为空白组(灌喂水)、模型组(灌喂水)、低浓度组(模型小鼠灌胃2 g/kg/day PSE)、中浓度组(模型小鼠灌胃10 g/kg/day PSE)、高浓度组(模型小鼠灌胃50 g/kg/day PSE)、酮洛芬组(模型小鼠灌胃5 mg/kg/day 酮洛芬)共6组，雌雄各半，分笼饲养。小鼠均在温度、灯光自动控制的动物室饲养(温度22℃、湿度60%)，自由饮食。

1.2 主要试剂及仪器

Ⅱ型胶原蛋白、弗氏完全佐剂来自美国sigma公司。游标卡尺来自桂林广陆数字测控有限公司；超速低温离心机来自美国Eppendorf公司产品；小鼠TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒来自伊莱瑞特生物科技有限公司；孵育箱来自德国Eppendorf公司产品；酶联免疫检测仪来自德国Eppendorf公司产品。

1.3 药物处理

鸡矢藤从北京同仁堂(集团)有限责任公司购买，并由海南医学院药学院刘嫱副教授鉴定，样本留存编号(174)。鸡矢藤水煎液：取鸡矢藤全草，用水煎煮3次，过滤后，冻干保存。

1.4 ClA模型的建立

实验前，将牛Ⅱ型胶原蛋白溶解在0.1 mol/L的乙酸中，在低温(4℃)通过混匀使蛋白充分溶解，所得的混合液质量浓度为2 g/L，放置在4℃冰箱中过夜，之后配置完成2 g/L的弗氏完全佐剂；将两种混合液等体积进行混合、震荡、乳化，制作成含有Ⅱ型胶原的乳剂，此时每1 mL的乳剂中含有1 mgⅡ型胶原蛋白与1 mg卡介苗。用该乳剂对每只小鼠的尾部根处多点进行皮内注射，剂量为0.1 mL，此时记为第0 d，在第20 d时再次用0.1 mL该乳剂进行腹腔注射用于，加强免疫。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 小鼠关节肿胀度测定及关节评分

各组分别于0、4、8、12、16、20、24、28 d测定踝关节肿胀度，以小鼠后足造模前与造模后足垫厚度作为关节肿胀度。观察小鼠后足爪，并按如下标准进行关节炎指数评分。小鼠爪子关节正常，没有红肿记为0分；小鼠足踝或足趾轻微红肿记为1分；小鼠足踝或足趾中度红肿记为2分；小鼠整个足爪严重红肿记为3分；小鼠足爪关节变形导致小鼠行动不便记为4分。小鼠关节肿胀度及关节评分用于评估各组小鼠发病情况并进行统计学分析。

1.5.2 小鼠关节组织形态学观察

取小鼠完整踝关节组织去皮后置于10%中性福尔马林中固定，8%EDTA溶液脱钙，常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，苏木素—伊红(HE)染色。光镜下观察炎性细胞的浸润和小血管的增生、软组织的水肿及组织纤维化等情况。

1.5.3 小鼠血清TNF-α、IL-1β检测

采用ELISA方法按照试剂盒说明书进行操作，先加入标准品和待测样品，设阴性对照，37℃反应30 min温育，后洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应，洗板5次，加入显色液，37℃显色15 min，加入终止液，酶标仪检测吸光度(OD值)，重复3次，取平均值。

1.5.4 统计学处理

2 结 果

2.1 一般状态观察

空白组以及中浓度PSE组和高浓度PSE组的小鼠精神饱满，饮食规律，符合喂养量要求；体毛润滑光泽，活动正常，行动迅速；排尿及排便正常且无其他异常表现。低浓度PSE组以及模型组的小鼠的精神尚可，饮食规律但低于喂养量的要求；体毛欠光泽；少动且行动稍缓；排尿及排便量正常且无其他异常表现。模型组精神欠佳；体毛无光泽且稀疏；少动且行动迟缓。

2.2 鸡矢藤水煎液对胶原诱导性小鼠RA关节肿胀度的影响

CIA建模后，小鼠的关节肿胀度显著增加，在建立模型后26 d达到高峰，差异有统计学意义(＜0.05)。经各浓度PSE及酮洛芬处理后，小鼠关节肿胀度在给药后关节肿胀度均显著降低，差异有统计学意义(＜0.05)，见表1。各组小鼠关节组织对比结果见图1。

图1 各组小鼠关节肿胀情况比较

表1 鸡矢藤水煎液对胶原诱导性小鼠RA关节肿胀度的影响(± s，N=10)

模型组小鼠的平均关节指数临床评分达3分。相对模型组，各组小鼠关节红肿情况明显缓解，其中以高浓度组和酮洛芬组的关节评分曲线快速下调，见图2。

图2 鸡矢藤水煎液对胶原诱导性小鼠RA关节肿胀度及关节评分的动态变化

2.3 鸡矢藤水煎液对各组小鼠关节组织病理形态的影响

空白组小鼠关节组织未见明显炎性细胞浸润、软组织的水肿及内部血管的扩增；模型组小鼠的关节组织可见软组织的水肿及内部血管的扩增，所占视野大于60%，血管周围满布炎症细胞(以中性粒细胞及巨噬细胞为主)，存在重度组织纤维化；PSE低浓度组关节组织关节软组织局部中度炎症细胞浸润，小血管增生，血管周围存在多数的炎症细胞，可见软组织水肿；PSE中浓度组关节可见局部轻度炎症细胞浸润，所占视野小于30%，有轻微小血管增生，无组织纤维化；PSE高浓度组仅见少数小血管增生，无明显炎性细胞浸润、水肿；酮洛芬组小鼠关节可见少许炎症细胞浸润，但无明显的组织水肿及小血管增生，见图3。

图3 各组小鼠关节肿胀度对比

2.4 鸡矢藤水煎液对胶原诱导性小鼠RA血清中TNF-α和lL-1β水平的影响

在RA模型小鼠中，血浆中TNF-α含量显著升高；经中浓度及高浓度PSE及酮洛芬处理后TNF-α含量均显著降低，差异有统计学意义((＜0.05)。相似的，在RA模型小鼠中，血浆中IL-1β含量显著升高；经各浓度组PSE及酮洛芬处理后，IL-1β含量均显著降低，差异有统计学意义((＜0.05)，见图4。

图4 鸡矢藤水煎液对胶原诱导性小鼠RA血浆中炎症因子的影响。血浆中TNF-α，和lL-1β水平。

3 讨 论

RA是一种以对称性多关节炎病变为主要临床表现的自身免疫性疾病，病变前期主要是关节滑膜的炎症性病变表现，末期则会发生滑膜细胞的增生，以及骨和软骨的进行性破坏。RA关键的病理表现是关节滑膜的慢性炎症，早期表现是关节滑膜的水肿充血，随着病情进展可出现血管翳、软骨和软骨下骨破坏并出现病变的关节部分。许多种类的免疫活性细胞和细胞因子、炎症介质共同参与RA的一系列发病过程，对RA的异常免疫反应有着非常重要的作用，其中Ⅱ型胶原蛋白能诱导小鼠关节炎症的产生，对实验参考具有临床意义。

研究发现，免疫因子TNF-α和IL-1β在RA的病情发生发展过程中有着十分关键的作用。TNF-α是在RA免疫反应过程中有着重要地位的炎症介质，其在引起组织损伤和介导机体炎症反应起着重要的作用。RA病变关节滑膜中的滑膜巨噬细胞产生TNF-α，是TNF-α的主要来源。一般来说，TNF-α和IL-1β两种细胞因子能够增加内皮细胞E-选择素的活性，强化中性粒细胞的集聚，内皮细胞表面黏附分子和活化的中性粒细胞发生黏附，不断向关节滑膜蔓延，分泌出炎症介质，引发RA关节部位的炎症反应。Chen CJ等认为TNF-α和IL-1β是炎症的启动因素，能够与关节滑膜细胞中的IL-1β受体相互产生反应，使接头蛋白MYD88发生激活，通过使NF-kB启动，引发继发性的炎性细胞因子转录，增加关节受损。上述机制反映抑制RA患者血清中TNF-α和IL-1β两种炎性介质的水平，使免疫通路的失调，从而破坏自身组织和抗原的免疫，是阻断RA炎症反应中细胞因子损伤关节的途径。此为治疗RA炎症反应进行性发生发展导致关节组织破坏的有效方式之一。

本实验结果提示：CIA建模21 d后，模型组、低浓度组、中浓度组、高浓度组、酮洛芬组与空白组进行比较，其小鼠的关节肿胀度显著增高。说明Ⅱ型胶原蛋白能够引发小鼠的关节炎，且免疫反应方面与人类RA十分类似，这与文献报道的相同，特别是Th细胞及其分泌的致炎细胞因子在RA的发病过程中起着非常关键的作用。因此本实验采用CIA小鼠为模型来探究鸡矢藤水煎液对RA的部分作用机理。通过给药处理28 d后发现鸡矢藤与酮洛芬均能降低CIA小鼠的关节肿胀度及TNF-α和IL-1β的水平，及能够改善关节组织中炎性细胞的浸润、血管新生及软组织的水肿情况，且高浓度组较为明显。该结果提示鸡矢藤水煎液对CIA小鼠具有一定的抑制效果，能够降低小鼠血中TNF-α、IL-1β的水平。

综上所述，鸡矢藤对小鼠胶原诱导性关节炎具有一定的治疗作用，能够降低CIA小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表达水平，从抑制炎性细胞蔓延、缓解关节滑膜的损伤，起到减轻关节炎症的作用，因此鸡矢藤水煎液对类风湿关节炎具有治疗效果。本实验旨在针对鸡矢藤水煎液对小鼠类风湿关节炎的影响，研究其抗风湿机制，为鸡矢藤的进一步开发和利用提供科学依据，为类风湿性关节炎提供新的治疗药物。