一种新型生物活性膜的制备及对鲜切苹果的保鲜效果

付瑞敏 杨雪 夏铁骑 王丁 张红 陈五岭

摘要：为制备兼具抗氧化和抗菌性能的壳聚糖食品防腐保鲜膜，以壳聚糖（CH）-甘油（GLY）-茶渣提取物（TRE）为原料，制备了一种防腐保鲜活性膜。并在此基础上采用色度测量、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）、抗氧化性分析、鲜切苹果保鲜效果评价和抗菌分析等方法对所得膜的光学特性和理化特征进行了研究。色度测量结果表明，不同浓度的TRE加入会增加活性膜的光泽度;FTIR结果表明，甘油的添加会增强茶渣提取物与壳聚糖之间的相互作用;电镜观察结果表明，复合膜的各组件之间具有良好的相容性;抗氧化性分析结果表明，壳聚糖复合茶渣提取物所制备的活性膜具有良好的抗氧化活性，DPPH自由基清除能力为86.6%;鲜切苹果的保鲜效果评价结果显示，与对照组相比，活性膜处理可有效维持鲜切苹果的硬度、维生素C含量及可溶性固形物的含量，延缓了MDA的上升，显示出了良好的保鲜效果;抗菌性分析结果表明，含有15%甘油和20%TRE的壳聚糖膜抑菌圈最大，抗菌性最强。本研究所制备的活性膜在鲜切水果的防腐保鲜方面有较好的应用前景。

关键词：壳聚糖;茶渣提取物;抗氧化;活性膜

中图分类号：TS255.3 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2022）11-0182-07

收稿日期：2021-12-17

基金项目：国家留学基金委地方合作项目（编号：10006）;河南省科技攻关项目（编号：182102110002）;河南省高等学校青年骨干教师资助计划（编号：2020GGJS265）;河南省高等学校重点科研项目（编号：21B180002）;河南省教育厅人文社科指导项目（编号：20200040）。

作者简介：付瑞敏（1981—），女，河南郑州人，博士，副教授，主要从事农业及食品微生物研究。E-mail：angelaminmin@163.com。

通信作者：陈五岭，博士，教授，主要从事食品微生物研究。E-mail：wuling.chen@263.net。

食品安全问题始终是当前社会关注的焦点，其中，由微生物原因引起的食品安全问题占了相当大的比重。为防止微生物污染，蔬菜、水果等在采摘后通常需要包被一层防腐保鲜膜，之前的保鲜膜多为聚乙烯，但大量使用会导致资源的消耗和废弃物的产生，后者会引起严重的环境污染。因此，寻找开发安全可降解的环境友好型包装材料是当前果蔬防腐保鲜领域的研究热点。鲜切苹果是将新鲜采后苹果经切分包装上市销售的新型半加工产品。与新鲜采摘后苹果相比，鲜切苹果在贮藏中更易染菌和发生褐变，从而導致其品质和商品价值下降。研究表明，水果在贮藏期间的保鲜度与其抗氧化、抗菌等性能密切相关，因而鲜切苹果贮藏保鲜的技术核心是探索一种包装设备使其能有效维系鲜切苹果在贮藏期的保鲜度与抗氧化活性。

茶渣（tea residue，TR）作为茶饮料加工中的副产品，通常被直接废弃，这不仅造成了环境的污染，也形成了资源的浪费。研究表明，茶渣中富含茶多酚和没食子酸等生物活性物质。茶多酚作为一种天然多酚类物质，具有抗氧化、抗菌、抗诱变、抗炎和抗癌等功效，在保健品生产加工、食品包装及疾病的预防治疗等领域具有广泛的应用。

壳聚糖（CH）是一种可降解多糖，以其安全、抗菌、具有较好的延展性和成膜性等特点被广泛用于食品加工的防腐保鲜。它可作为多酚、水杨酸等生物活性化合物的载体，与这些具备抗氧化性抗菌性的活性物质共同用于食品包装防腐保鲜活性膜的制备与开发。课题组前期为增强活性膜的抗菌性，将生物拮抗菌与壳聚糖进行相应比例的复配，制备出抗真菌活性较强的活性膜。Kurek等从蓝莓或葡萄皮渣中提取多酚并将其同壳聚糖复配，以开发用于食品包装的生物活性膜，最终获得易于处理的且抗氧化活性与总酚含量成正比的膜。

在食品包装领域，茶渣中的没食子酸可通过与壳聚糖分子形成氢键等理化作用方式与壳聚糖结合，从而提高壳聚糖膜的力学特性。因此，将茶渣提取物（tea residue extract，TRE）复合壳聚糖制备防腐保鲜膜，可同时满足环境友好和增强果蔬抗氧化活性的双重需求。既有效解决茶渣造成的环境污染，又变废为宝，提升膜的保鲜效果。

甘油（glycerinum，GLY）因具有高吸水率和低成本的优点已经在食品包装材料方面得到了广泛应用。它能够对各种物理条件、化学条件以及水、pH值、热、紫外线、日光、静电场、磁场以及物理化学和微生物特性等刺激作出快速的可逆响应;此外，甘油具有相似于多糖的结构和亲水性，故甘油和多糖具备良好的成键性，可与其互作形成氢键。因此，甘油在食品、伤口敷料以及再生药物的组织工程等方面均得到了广泛应用。

为探索一条新的环境友好型食品防腐保鲜路径，本研究以富含多酚类物质的茶渣提取物（TRE）、壳聚糖（CH）以及甘油（GLY）为原材料，制备一种新型的鲜切水果保鲜膜。采用红外光谱分析、扫描电镜观察、热重分析、抗氧化性分析、抗菌性分析等方法对所制备膜的结构及特性进行表征研究，并研究该膜对于鲜切苹果在贮藏期间硬度、维生素C含量及可溶性固形物含量等各项指标的影响情况，以期对该活性膜在鲜切水果防腐保鲜中的应用价值做出探索和评估，从而为新型食品防腐保鲜包装材料的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料 本研究所用的壳聚糖（分子量为375 ku）、甘油（纯度99.0%）、乙酸溶液（纯度99.0%）、氢氧化钠（NaOH，99%）和盐酸（HCl，36.5%～38.0%）均购自郑州优吉生物科技有限公司，所有试剂纯度均为分析纯，使用前无需进行进一步纯化。试验用水均为双蒸水。本研究抑菌试验所用的假单胞菌（Pseudomonas sp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）均由陕西省微生物研究所馈赠，茶渣取自信阳恒兴茶饮品有限公司，苹果购自陕西白水。

1.1.2 试验仪器 GY-4型数显式果实硬度计，购自北京阳光亿事达科技有限公司;ATAGO数显式手持糖度仪，购自广州市爱宕科学仪器有限公司;UV1800型紫外分光光度计，日本岛津生产;傅里叶红外光谱仪，购自苏州津工科技有限公司;Xrite 2600d 手持色度仪，购自上海色彩科技有限公司;S4800扫描电子显微镜，购自日本日立科学仪器（北京）有限公司;LS192光泽度测试仪，购自深圳林上科技有限公司。

1.1.3 试验时间与地点 试验于 2020年9—12月在陕西师范大学微生物工程与技术研究院进行。

1.2 试验方法

1.2.1 茶渣溶剂萃取

取100 g茶渣低温干燥，研磨粉碎，将其加入 2 000 mL 体积分数为70%的乙醇溶液，将溶液pH值调整为2，低温避光萃取12 h。而后将其置于 40℃ 水浴锅中处理8 h，使用旋转蒸发仪除去乙醇并浓缩，然后将所得的提取物置于 4℃ 保存以备后用。

1.2.2 壳聚糖-甘油-茶渣提取物（CH-GLY-TRE）膜材料的制备

参照de la Caba等的方法进行生物活性膜的制备，并在此基础上进行了一些修改。首先，分别将1 g壳聚糖（GH）加入2个各放有100 mL乙酸溶液（浓度为0.1 mol/L）的烧杯中，室温下搅拌45 min后制成2杯壳聚糖溶液;将10 g和20 g茶渣提取物（TRE）分别加入到这2个烧杯中并做好响应标记，室温下继续搅拌30 min后，再往这2个烧杯中分别加入15 g的甘油，室温下继续搅拌30min直至溶液CH-GLY（15%）-TRE（10%）和CH-GLY（15%）-TRE（20%）完全均质化。将溶液分别倒入直径为150 mm的培养皿中，所得产物为膜材料T和T。依照同样的方法，制备了不含TRE的对照组CH薄膜（C）和CH-GLY（15%）薄膜（C）。

1.2.3 活性膜的色度和光泽度检验 参考文献[12]，使用色差仪测定T、T、C、C的色度值及亮度（L）、红/绿（a）、黄/蓝（b）。测量前使用标准白色校准板进行校准，并按照公式（1）计算色差。

ΔE=（L-L）+（a-a）+（b-b）。（1）

式中：L、a、b分别代表薄膜的亨特系数值，L、a、b分别代表校准板的亨特系数值，L=103.98，a=-5.80，b=9.25。使用光泽儀测量各个活性膜的光泽度，入射角为60°，每个样品均测量10次。

1.2.4 红外光谱分析 采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR，光谱范围为4 000～1 000 cm，分辨率为4 cm）法对T、T、C、C红外吸收光谱进行分析测定，结合FTIR数据库结果分析判断各官能团之间可能存在的相互作用。

1.2.5 扫描电镜分析 本研究采用S4800扫描电子显微镜（SEM）对T、T、C、C等各活性面膜的形貌进行了表征。扫描电压分别为10、15、20 kV。

1.2.6 抗氧化性分析 参考卢俊宇等的方法，在避光条件下，将DPPH和无水甲醇制备成100 mL体积分数为3%的DPPH-无水甲醇溶液。将复合膜裁成边长为50 cm的正方形，而后将复合膜浸泡在装有100 mL 95%乙醇溶液的烧杯中，室温下浸泡4 d后，将烧杯中溶液搅拌均匀后，取2 mL溶液和 2 mL DPPH-无水甲醇溶液混合，将混合液搅拌均匀并于室温下沉淀30 min。而后以DPPH溶液为对照，测混合溶液在570 nm处的吸光度，按照公式2计算DPPH自由基清除率（I）。

I=D-DD×100%。（2）

式中：D为DPPH溶液的吸光度;D为样品溶液与DPPH混合后的吸光度。

取等量的C、C、T、T活性膜将其分别浸泡在装有100 mL 95%乙醇溶液的烧杯中，称质量计为m，室温下浸泡4 d后再称质量计为m，用公式（3）计算质量损失M。

M=m-mm×100%。（3）

式中：m为各活性膜在浸泡乙醇之前的质量;m为各活性膜在浸泡乙醇之后的质量。

1.2.7 保鲜效果分析 选择大小新鲜度一致的苹果将其清洗后，用不锈钢刀片将苹果去皮，制成边长为6 cm的立方体，而后将果块置于浓度为 0.1 mmol/L 的次氯酸钠水溶液中，浸泡2 min，然后用自来水冲洗掉残留的次氯酸钠，晾干后，随机分成5组，每组20块鲜切果，各组处理方法见表1。

将各组的鲜切苹果予以浸泡涂膜处理，而后将其分装于市场购买的PE保鲜袋中，将其置于15℃环境下（该环境模拟超市中鲜切水果储存的恒温库）中贮藏6 d。其间，参考文献[14-17]，每天对各处理组的硬度、可溶性固形物、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和维生素C含量进行测定。

1.2.8 抗菌性试验分析 将假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌从固体斜面上转接至液体培养基中，37℃培养12 h后，分别取1 mL发酵液将其均匀涂布于平板上，采用牛津杯法测定各复合膜的抑菌性能。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0进行数据处理，数据采用“均值±标准差”表示，使用Origin Pro 9.0和Adobe Illustrator 5.0作图。

2 结果与分析

2.1 各活性膜的光学特性研究

采用色差计和光泽度仪对所制备的T、T、C、C各活性膜进行色差和光泽度测量。由表2可知，没有添加茶渣提取物的对照组C和C的L值趋于一致，说明是否添加壳聚糖对亮度的影响不大，随着TRE添加量的增加，T和T组的亮度有了明显下降，说明TRE含量的增加使膜材料的颜色逐渐加深。相对比不添加TRE的CG-GLY而言，添加了TRE的复合膜其a值和b值均为正值且随TRE的添加量增大而增大。a代表红绿指数，其正负值分别代表红和绿，b代表黄蓝指数，其正负值分别代表黄和蓝。结果表明，TRE的添加使膜中的红色和黄色色度增加，这与茶多酚本身所带的色素有关。此外，薄膜光泽度的高低与复合膜表面的粗糙度有关，具体表现为：光泽度越低，粗糙度越高。表2中所显示的各个复合膜的光泽度均低于50，表明所制备的活性膜表面不是很光滑，且通过对比各组膜的光泽度，发现TRE和GLY的添加对膜表面的光泽度会有所提升，说明TRE可能同CH发生了一些相互交联作用，进而对膜表面结构产生了相应的影响。C膜的光泽度高于C，说明GLY的加入对于CH膜的光泽度有所提升，这表明GLY作为塑化剂在CH成膜系统中起到了积极作用。此外，TRE的加入使得膜光泽度有了进一步的提升，参考王博等的研究结论，推测是由于TRE中富含的茶多酚等物质与GLY和CH发生了相互作用，形成了结构较为均一的共聚物。

2.2 红外光谱分析

由图1可见，在3 000～3 750 cm之间有1个很宽的条带，与—OH和N—H的拉伸振动有关。对比CH组，添加了TRE和GLY的复合膜在该处的峰强度有不同程度的增加，表明复合膜中羟基量有所增加。此外，图中CH-GLY-TRE复合膜在1 640、1 540 cm处出现了O—H、C—O的伸缩振动，说明复合膜中形成了酰胺键。此外，FTIR中各复合膜的特征峰表明TRE与CH的反应并未改变CH本身的骨架结构，这与Pasanphan等的研究结果一致。

2.3 SEM结果分析

由图2可见，构成复合膜的CH、GLY和TRE彼此间具有良好的相容性。由图2-a、图2-b可知，当壳聚糖膜中添加甘油时，膜表面变得有些粗糙，出现一些褶皱结构，这是甘油塑化作用所致。图 2-c、图2-d显示，TRE的加入引起活性膜微观结构的改变，具体表现为添加TRE的活性膜表面变得更光滑和平整，但仍可以清晰地观察到活性膜表面的纤维结构，推测是TRE中的茶多酚等物质连接到壳聚糖分子上并在干燥处理时填充到了壳聚糖分子所形成的网格间，从而使活性膜的结构更紧致。电镜结果与光泽度检测结果一致，说明添加TRE成分有助于提升活性膜的光澤度和平整性。

2.4 抗菌特性研究

由图3可见，添加了TRE的CH膜，抑菌圈较对照组明显增大，且抑菌圈直径随TRE添加量的增加而增加。因此，综合各复合膜的抗菌特点，CH-GLY（15%）-TRE（20%）的抑菌效果最好。研究表明，壳聚糖的抑菌机制在于它可与弱酸发生反应形成阳离子生物絮凝剂，絮凝过程中可导致微生物细胞沉聚在一起，同时壳聚糖还可密集分散在细菌细胞表面从而影响菌体对营养物的吸收以及代谢废物的排出。壳聚糖与茶渣提取物复合制备的活性膜相对比壳聚糖本身而言，其抗菌性增加的原因主要在于茶叶提取物中的茶多酚可增强壳聚糖的脱乙酰化程度，而后者可增强壳聚糖分子链上胺基的质子化程度，胺基的质子化程度增高进而会使壳聚糖在稀酸溶液中的带电基团增多，从而提升壳聚糖的抗菌性能;此外，茶渣提取物中所含的没食子酸、 茶多酚等物质的羟基可与菌体蛋白的氨基或者羧基发生反应进而发挥抑菌性能。

2.5 抗氧化特性研究

由表3可见，含GLY的薄膜CH-GLY和CH-GLY-TRE其质量损失值均高于不含GLY的薄膜CH，根据相似相溶原理，推测是由于GLY和TRE中的茶多酚等物质发生溶解，进而导致质量明显下降。

由图4可见，在抗氧化能力方面，添加TRE复合膜T和T组的DPPH自由基清除率很高，而没有添加TRE活性膜的C和C组不超过50%。通过对比4组活性膜的抗氧化活性，发现GLY的添加对活性膜抗氧化能力的提升帮助不大，该结果与Choque等的结果一致，甘油的主要作用是提升壳聚糖的弹性，自身不具备清除自由基的能力。

2.6 CH-GLY-TRE对鲜切水果的保鲜效果研究

由图5-a可以看出，没经过任何涂膜处理的对照组中鲜切苹果的硬度下降极其明显，而与之相对的是，经过茶渣提取复合壳聚糖及甘油涂膜处理的T组和T组的鲜切苹果在为期6 d的储藏期内维持了较好的硬度。说明本试验中所制备的保鲜膜可有效延缓鲜切苹果硬度的下降趋势。

丙二醛是果实细胞膜脂受超氧阴离子和羟基自由基的作用所形成的过氧化产物，其含量的升高暗示着果实细胞衰老的加剧。由图5-b可见，随着处理时间的不断延长，各处理组鲜切苹果的MDA含量均呈现上升趋势，其中，尤以对照组（CK）上升最为明显。添加了TRE的处理组（T、T）上升相对更为平缓，且TRE含量高的T组MDA含量较T组低，说明茶渣提取物可通过有效降低果实的过氧化程度来延缓果实衰老。

本试验中各组鲜切果实的维生素C含量如图 5-c 所示，由图5-c可知，随着贮藏时间的延长，各处理组的维生素C含量均呈现下降趋势，推测其原因可能是在机械损伤的环境胁迫作用下，果实细胞的生理代谢代偿性增强，氧化作用增强进而导致维生素C被氧化分解。对比未经过涂膜处理的CK组，所有涂膜处理的果实其维生素C含量均高于CK，且添加了TRE的T组和T组显示了较高的维生素C含量，说明茶渣提取物可较好地延缓鲜切苹果中维生素C含量的下降。可溶性固形物主要是指果实中所含的可溶性糖类，其含量反映了果实的成熟程度。本研究测量了储藏期间各组处理鲜切果中的可溶性固形物含量，所得结果如图5-d所示。由图5-d可知，各处理组的可溶性固形物含量均随着贮藏时间的延长而呈现不同程度的下降趋势，其中尤以未经处理的对照组下降最快，而以经CH-GLY（15%）-TRE（20%）活性膜处理的T组下降最慢。結果表明，对鲜切苹果进行涂膜处理可有效延缓储藏期间果实的硬度、维生素C含量和可溶性固形物含量的下降以及MDA含量的上升。

3 讨论与结论

本研究以壳聚糖（CH）、甘油（GLY）和茶渣提取物（TRE）为原料，制备了用于鲜切水果包装的生物活性膜，并对活性膜的光学特性、抗菌特性和抗氧化特性进行了分析研究，并对鲜切苹果的保鲜效果做出评价。光学特性检测结果发现在CH中加入GLY和TRE可提升活性膜的光泽度，FTIR和SEM检测结果显示TRE可通过分子间的相互作用与CH和GLY形成的复合膜相连接;抗菌性能和抗氧化性能试验结果表明，TRE的添加有助于活性膜抗菌性能和抗氧化活性的提升。评价各处理组对鲜切苹果的保鲜效果，结果显示，添加TRE的活性膜对维持鲜切苹果的硬度、维生素C含量和可溶性固形物含量和硬度均具有较好的效果。

在苹果贮藏期间，果实中的纤维素和果胶等物质的分解和果实中水分的蒸发均会导致果实硬度的下降，因此，可通过测量果实的硬度来反映果实的衰老程度。通过测定各处理下鲜切苹果的硬度指标发现，不经任何涂膜处理的对照组中苹果的硬度下降很快，储藏至第6天其硬度就已经降至6 N以下。Harker等报道，果实硬度低于6 N，则该果实就不再具备商业价值，对鲜切果予以壳聚糖处理（C组）后等到第6天果实硬度才低于6 N，说明壳聚糖处理对延缓果实衰老具有一定的功效，这与笔者所在课题组前期所得结果一致。壳聚糖结合甘油处理组（C组）对于鲜切果的硬度影响与单独壳聚糖处理趋于一致，但硬度维系效果优于C组，说明壳聚糖与甘油相互交联形成的物理屏障有助于延缓鲜切果衰老。其中，添加了茶渣提取物（TRE）的处理组T和T的果实硬度下降最小，说明茶渣提取物中的活性成分能有效延缓果实的软化速度。造成鲜切果实软化的原因大致有果实自身生理代谢和微生物感染2类。其中，鲜切苹果因切分处理所致的机械损伤而引发果实内部呼吸作用及酶促褐变等生理代谢过程出现代偿性增加，这会增加果胶的液化和细胞壁的破坏，进而导致果实软化。茶渣中有茶多酚、没食子酸等抗氧化活性成分，它们可通过降低鲜切果实酶促褐变、抑制腐败菌繁殖等方式降低果胶及纤维素等成分的水解和液化，从而维持果实硬度。

丙二醛是果实细胞膜脂受超氧阴离子和羟基自由基的作用所形成的过氧化产物，通常在果实受到冻伤、病害或机械损伤等胁迫时产生。对于带有机械伤口的鲜切苹果，其MDA的积累量可作为果实衰老度的重要指标，其含量的升高暗示着果实细胞膜脂过氧化程度以及细胞膜损伤程度的升高，即暗示着果实细胞的衰老加剧。丙二醛含量测定试验中，发现各处理组中鲜切苹果的MDA值的增势是随TRE添加量的增加而递减的，推测其原因一方面是由于茶渣提取中含有的多酚抗氧化物质降低了果实膜脂的过氧化作用;另一方面是由于活性膜中的壳聚糖通过与甘油的交联阻碍了鲜切果实与氧气的接触，进而通过降低鲜切果实的呼吸而减弱果实脂质的过氧化作用。

维生素C是苹果中富含的一种营养成分，作为一种抗氧化剂，它可有效清除果实内活性氧，进而帮助果实延缓衰老。故维生素C含量的测定通常也是衡量苹果果实衰老程度的指标。本研究中通过对比各处理组鲜切苹果的维生素C含量，发现添加了TRE的T组和T组显示了较高的维生素C含量，说明茶渣提取物可较好地延缓鲜切苹果中维生素C含量的下降，推测其原因是由于茶渣提取物中富含较多的酚羟基，这些酚羟基可减弱果实的氧化作用从而对维生素C起到了保护作用。

可溶性固形物主要是指果实中所含的可溶性糖类，其含量反映果实的成熟程度。本研究对比各处理组果实中的可溶性固形物含量，发现随着储藏时间的延长，各处理组果实中可溶性固形物均呈不同程度的下降趋势，从高到低依次为CK>C>C>T>T。这是由于鲜切苹果的加工过程会给苹果果实造成一定程度的机械损伤，后者会导致苹果果实内部的呼吸作用急速增强，进而导致可溶性糖类大量消耗，故造成各处理组鲜切果实内部可溶性固形物含量均呈下降趋势。此外，在各处理组中添加了TRE的T组和T组的果实可溶性固形物含量下降趋势最为缓慢，可能是因为茶渣提取物中的没食子酸等物质一定程度上抑制了果实的呼吸作用及生理代谢，使其糖消耗量下降。因此，添加TRE的活性膜可有效延缓鲜切苹果贮藏期间可溶性固形物的损耗，使其在贮藏期间保持良好品质。总之，本研究所制备的活性膜具有成本低廉、操作简便、保鲜效果显著等优点，该方法在食品活性膜的加工制备以及果蔬的防腐保鲜等方面具有广阔的应用前景。

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