基于网络药理学和分子对接探究麻黄加术汤治疗类风湿关节炎的潜在作用机制

李晓丽, 应天昊, 唐一迪, 祝璇, 孙萌萌, 余涛, 赵佳宁, 张雷明

(烟台大学 药学院 分子药理和药物评价教育部重点实验室，山东 烟台 264005)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜过度增殖和炎症细胞浸润为特征的慢性炎症性关节疾病，会导致进行性关节损伤，甚至残疾，严重影响患者的生活质量，给社会和家庭带来沉重的负担[1-2]。全球RA的平均患病率约为0.5%～1.0%[3-4]，可出现在任何年龄段，以老龄和女性居多。在我国，随着人口老龄化加重，RA患者人数也在逐年增多[5]。然而，RA的发病机制复杂，治疗通常是以缓解症状来提高患者生活质量。

目前，临床治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药、免疫抑制剂和生物制剂，在一定程度上都可缓解病症，但长期使用会产生不同程度的不良反应，患者依从性低[6-7]。RA在中医中属于“痹症”“尫痹”“历节”范畴[8-9]。在《金匮要略·痉湿暍病脉证治第二》中，麻黄加术汤是主治“湿家身烦疼”的重要方剂，其由麻黄、桂枝、甘草、杏仁、白术五味中药配伍而成[10]。麻黄辛温散寒、利水消肿，甘草补中益气，桂枝温经通脉，白术除湿，杏仁利气祛湿[11-12]。张仲景在《金匮要略》中指出“麻黄加术，则虽发汗不至多汗，而术得麻黄，并可行表里之湿下趋水道，又两相维持也”[13]。有研究表明，麻黄加术汤可能通过降低IL-1β、TNF-α水平，抑制炎症细胞浸润和纤维组织增生从而发挥治疗作用[14]。同时，麻黄加术汤还可以降低RA患者体内T细胞亚群平衡来调节患者的免疫功能[15]。然而，对于麻黄加术汤在RA治疗中的主要药效成分和作用机制尚不明确，而中药中的化学成分可以通过作用于机体内多个靶点来发挥治疗作用，这也给中药的研究带来一定的挑战。

近年来，随着生物信息学技术的迅猛发展，网络药理学可以从整体上探索药物与疾病的相关性，是从系统上揭示中药分子机制的重要手段[16]。因此，本文通过网络药理学和分子对接的方法，对麻黄加术汤治疗RA的有效成分、靶点和作用机制进行预测和分析。

1 材料与方法

1.1 麻黄加术汤活性成分和靶点获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，获取麻黄加术汤中麻黄、桂枝、甘草、杏仁和白术5种中药的化学成分，以药动学(absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME)参数[17](口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18)为条件进行筛选，共得到131个活性成分。通过Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载活性成分的SDF结构文件，上传至Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中检索靶点，按P>0.5筛选后即得到活性成分作用靶点。通过Uniport数据库对靶点进行标准化处理。

1.2 RA潜在靶点获取

在GeneCards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)和在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https://www.omim.org/)数据库中，以 “Rheumatoid Arthritis” 为关键词进行检索，去除重复值，整理疾病靶点并与活性成分靶点取交集，得到麻黄加术汤治疗RA的潜在靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作网络的构建

将1.2项获取的潜在靶点上传至STRING(https://string-db.org/)平台，限定物种为“人”，最低相互作用阈值设为“medium confidence”(0.7)，将结果文件导入Cytoscape 3.7.1软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络并对结果进行可视化分析。

1.4 活性成分-靶点-通路网络构建

构建活性成分-靶点-通路的Network和Type文件，并将其导入Cytoscape 3.7.1软件中，构建麻黄加术汤活性成分-类风湿关节炎靶点-作用通路网络图。

1.5 基因本体分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析

将潜在靶点导入Metascape(http://metascape.org/gp/)数据库，Input as species和Analysis as species都设置为Homo sapiens，将阈值设定为P<0.05，进行基因本体(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，并进行可视化处理，分析麻黄加术汤治疗RA的可能作用机制。

1.6 分子对接

通过Pubchem网站检索获取1.3项结果中排名前12名的关键化合物的SDF结构文件，并通过Open Babel 2.3.2软件将所选化合物的SDF结构文件转化为PDB文件，从Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)数据库中检索获得靶点蛋白PDBID。用AutoDockTools软件对受体蛋白进行修饰并转化为pdbqt格式。以麻黄加术汤中关键化合物为配体，RA和麻黄加术汤共同作用靶点为受体，利用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，得到结合能打分，作为评价指标对结果进行分析，这种结合能是衡量配体是否能与受体分子有效结合的重要指标。

2 结果与分析

2.1 麻黄加术汤活性成分获取

通过TCMSP数据库，以OB≥30% 和 DL≥0.18 为标准进行筛选，得到麻黄加术汤中的活性成分共131个，其中麻黄23个、桂枝8个、甘草92个、杏仁19个、白术7个，麻黄与桂枝共有成分2个，麻黄与甘草共有成分3个，麻黄与杏仁共有成分1个，甘草与杏仁共有成分6个，麻黄、桂枝与杏仁共有成分1个，桂枝、甘草与杏仁共有成分1个。根据OB值排序，列举出排名前20的成分，如表1所示。

表1 麻黄加术汤中OB值排名前20的活性成分Table 1 Active ingredients of Mahuangjiazhu Decoction by OB value (top 20)

表1(续)

2.2 RA潜在靶点获取

将2.1项中获取的活性成分导入SwissTargetPrediction数据库并对结果进行处理后，得到342个成分相关靶点。通过GeneCards、OMIM和Drugbank数据库共得到RA靶点1 165个。两者取交集后获得麻黄加术汤治疗RA的潜在靶点133个。

2.3 靶点PPI网络构建分析

潜在靶点的PPI网络图中包括126个节点、1 956条边，见图1。节点大小和颜色表示该节点度值的大小，节点越大、橙色越深，对应的度值越大。边的不同颜色和粗细代表不同的结合分数，边越粗、颜色越蓝，结合分数越大。根据网络拓扑学参数，以度值≥35为条件进行筛选，共得到22个核心靶点IL-6、TNF、TP53、STAT3、AKT1、VEGFA、CXCL8、JUN、MAPK8、MAPK1、IL-1β、MMP9、EGF、EGFR、PTGS2、CCL2、RELA、APP、ICAM1、MYC、IL-10、SRC，见表2，提示这些靶点蛋白可能在麻黄加术汤抗RA中发挥关键作用。

图1 潜在靶点PPI网络Fig.1 PPI network of potential targets

表2 核心靶点信息

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

将麻黄加术汤治疗RA的潜在靶点进行GO富集分析，得到GO条目2 283个，其中生物过程(biological process，BP)2 250条、细胞成分(cellular component，CC)89条和分子功能(molecular function，MF)152条。与BP相关的主要有对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、对无机物的反应等；与CC相关的主要有膜筏、膜微区、膜区等；与MF相关的主要有细胞因子受体结合、受体调节活性、细胞因子活性等。根据P<0.05选择 BP、CC和MF富集较高的前10个进行可视化并生成柱状图，见图2。

图2 麻黄加术汤治疗类风湿关节炎靶点的GO富集分析(排名前10)Fig.2 GO enrichment analysis of Mahuangjiazhu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis (top 10)

通过Metascape数据库对麻黄加术汤治疗RA的潜在靶点进行 KEGG 通路富集分析(P<0.05)，选取前20条通路，见图3。如图所示，这些潜在靶点主要富集在糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、癌症信号通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、TNF信号通路、乙型肝炎、恰加斯病(美洲锥虫病)、C型肝炎、麻疹等信号通路。

图3 麻黄加术汤治疗类风湿关节炎的KEGG通路分析(排名前20)Fig.3 KEGG enrichment analysis of Mahuangjiazhu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis (top 20)

2.5 药物成分-靶点-通路网络

由于潜在靶点较多，所以将筛选出的核心靶点构建麻黄加术汤活性成分-类风湿关节炎靶点-作用通路网络，见图4。其中，度值较大的成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、甘草查尔酮A、刺芒柄花素等，均与多个靶点连接。度值较大的靶点包括PTGS2、MAPK1、JUN、RELA、MAPK8等。度值较大的通路涉及了糖尿病并发症中的AGE-RAGE、癌症信号通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染等信号通路。

注：图中红色代表复方名，绿色代表中药名(以拼音首字母代表)，紫色代表核心靶点，黄色代表麻黄加术汤活性成分，蓝色代表作用通路。图4 药物成分-靶点-通路网络图Fig.4 Network of drug ingredients-targets-pathways

2.6 分子对接

选取PPI网络中度值排名靠前的10个疾病相关靶点蛋白(AKT1、PTGS2、MAPK1、MAPK8、RELA、STAT3、CXCL8、IL-1β、IL-6、TNF)，分别与药物成分-靶点-通路网络中排名前12的活性成分进行分子对接，结果见表3。配体与受体结合性越好，结合能越低，一般结合能≤-5.0 kJ/mol 表明有较好的结合活性[18]。麻黄加术汤中的药物活性成分与RA关键核心靶点对接分数均小于-5.0 kJ/mol，表明麻黄加术汤中的活性成分能较好地与RA相关靶点结合，潜在生物活性高。其中AKT1与PTGS2靶点与12种活性成分结合能力较好，表明二者具有较好的结合能力，潜在生物活性高。

表3 活性成分与PPI网络排名前10靶点的对接结果Table 3 Docking results of compounds in Mahuangjiazhu Decoction with top 10 targets sequencing in protein-protein interaction network

以对接结果最好的AKT1与Phaseol为例，采用分子对接的方法研究受体蛋白AKT1与Phaseol配体小分子之间的结合模式。图5为受体蛋白AKT1与Phaseol配体小分子之间的结合模式，氨基酸残基Ile290、Thr211与Phaseol配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Gln79、Trp80、Asp292、Thr291、Leu210、Tyr272、Leu264、Val270、Lys268与Phaseol配体小分子形成疏水相互作用。

图5 AKT1和Phaseol的分子对接图Fig.5 Molecular docking diagram of Phaseol and AKT1

3 讨论

近年来，中医治疗RA受到越来越多人的关注。中医认为，正气不足、气血两虚是RA的发病基础[19]。麻黄加术汤是湿法治疗RA的重要方剂，麻黄配伍白术，不仅能达到微微发汗的最佳程度，还能适当通利小便，达到内外除湿的功效[13]。在RA的临床治疗中，麻黄加术汤也可显著改善患者的关节功能，患者关节肿痛、麻木、肿胀等症状得到明显缓解，并且降低了不良反应和疾病复发率[20-21]。本文采用网络药理学的方法探讨麻黄加术汤治疗RA的潜在分子机制。

本研究通过对麻黄加术汤的初步筛选得到131个活性成分和1 165个RA治疗靶点，通过Venn图和PPI网络图得到交集靶点133个和药物活性成分与交集靶点结合的度值排名，得到与RA关系密切的核心蛋白，包括AKT1、IL-6、TNF、STAT3、VEGFA、MAPK8等。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过多种机制调节软骨细胞凋亡，影响关节炎病情的发展[22-25]。有研究证明，AKT1可以通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3-kinases/ protein kinase B/ mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)信号通路抑制RA大鼠的软骨细胞增殖，并促进细胞凋亡和自噬[26]。IL-6是主要的炎性细胞因子，能够促进大鼠滑膜成纤维细胞(FLS)中基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-9的表达，促进成骨细胞分化，造成机体内成骨细胞与破骨细胞紊乱失衡，影响RA炎症反应进展[27-28]。TNF可以刺激滑膜内破骨细胞产生，加剧骨损伤[29]。此外，TNF还可以诱导FLS增殖，刺激FLS中IL-1β、MMP-3的表达，进而破坏关节软骨，导致RA炎症反应进展[30-31]。综上所述，麻黄加术汤的有效成分可能通过调控AKT1、IL-6、TNF、STAT3、VEGFA、MAPK8等靶点来发挥治疗RA的作用。

通过GO富集分析得到了麻黄加术汤影响的生物过程包括对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、对无机物的反应等多个生物学过程，并通过 KEGG 对药物影响的疾病通路进行富集，结果显示其对AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、 TNF信号通路和Toll 样受体信号通路等有调控作用。有研究表明，AGE-RAGE可以刺激促炎因子的产生，同时，还可以充当炎症因子来激活先天免疫细胞，进一步导致关节炎的发展[32-33]。IL-17信号通路和TNF信号通路可以介导RA炎症反应，参与RA相关的破骨细胞、软骨细胞和滑膜细胞等的功能调节，刺激炎症细胞因子的产生，导致滑膜增殖、血管增生[34]。Toll 样受体信号通路的激活也可以诱导炎症因子的产生、FLS增殖以及中性粒细胞募集进而导致软骨破坏和关节损伤[35-36]。由此可推测，麻黄加术汤可能通过调节多种信号通路进而影响细胞凋亡、增殖和炎症反应来发挥治疗RA的作用。

本研究利用网络药理学及分子对接的方法对麻黄加术汤治疗RA的机制进行探讨，在药物成分-靶点-通路网络图中对麻黄加术汤治疗RA的关键活性成分进行筛选。分子对接结果显示，核心有效成分与核心靶点的结合能均≤-5 kJ/mol，说明成分与靶点的结合能力较好，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚的度值排名靠前，提示其在麻黄加术汤治疗RA中发挥的作用最大。有研究表明，槲皮素可以抑制RA小鼠体内中性粒细胞浸润，降低细胞中炎症因子水平，同时还能促进活化的中性粒细胞凋亡，进而发挥治疗RA的作用[37]。木犀草素可以抑制RA大鼠FLS增殖，同时也能降低MMP-1和MMP-3的分泌，通过抑制丝裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路和PI3K/Akt信号通路来达到治疗RA的目的[38]。山奈酚可以通过抑制MAPK通路来减少FLS迁移、肌动蛋白细胞骨架重组以及MMP的表达而发挥治疗RA作用[39]。槲皮素、木犀草素、山奈酚等成分能与RA的核心靶点结合较好，说明其可能是麻黄加术汤治疗RA的关键成分。

综上所述，麻黄加术汤可能是通过槲皮素、木犀草素、山奈酚等关键成分调节AKT1、IL-6、TNF等靶点以及AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路进而抑制机体炎症反应，发挥治疗RA的作用。本研究初步预测了麻黄加术汤治疗RA可能的作用机制，对于研究结果仍需要后续的实验予以验证。