微生物耦合CdS 光催化降解磺胺甲唑的机理研究

陈泉林，梁競文，曾翠平，刘广立，张仁铎，骆海萍

（1.中山大学环境科学与工程学院，广东省环境污染控制与修复技术重点实验室，广东广州 510006；2.中国科学院深圳先进技术研究院，深圳合成生物学创新研究院，中国科学院定量工程生物学重点实验室，广东深圳 518055）

产乙酸混菌中细菌种类丰富，并且存在天然的相互作用，其在代谢过程中的氧化还原反应也使其具备降解污染物的巨大潜能。同型产乙酸菌是一类能够利用乙酰辅酶A 途径固定CO2的微生物类群，在Cd2+胁迫下，同型产乙酸菌能够利用自身代谢过程在温和条件下形成具有特定形态和结构的CdS 纳米颗粒，CdS 在光激发下产生的电子能够为同型产乙酸菌提供电子供体，在无其他电子供体存在的情况下实现高效产酸和光能向化学能的转化〔5-6〕，该系统已在能源生产、生物制造等领域展现出巨大的潜力。然而，目前关于SMX 降解的研究多以纯菌为主，关于混合菌群-CdS 耦合系统降解SMX 的研究甚少。

微生物耦合半导体光催化系统能够结合微生物的生物催化性能和半导体材料的光催化降解性能，在含多环芳烃、偶氮染料等废水的处理中展现出优异的降解性能，但关于这一系统降解药品和个人护理用品（PPCPs）类污染物的效果及机制研究仍较为欠缺。在产乙酸混菌-CdS 耦合系统中，CdS 具有良好的导电性、较大的比表面积、优异的可见光催化性能以及良好的生物相容性，能够促进微生物的光电化学过程〔6〕。CdS 在可见光激发下产生的电子和空穴能够驱动氧化还原反应，将复杂污染物转化为结构简单的中间产物，光催化和生物催化的协同作用有望实现SMX 的高效降解。

本研究采用产乙酸混菌构建产乙酸混菌-CdS耦合系统，通过SEM、EDS、XRD 表征证实CdS 在细菌表面成功合成，考察了该系统对SMX 的降解性能和CdS 浓度对降解效果的影响，利用LC-MS 分别探究了SMX 的生物降解路径、光催化降解路径以及在微生物耦合光催化系统中的降解路径。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

自养培养基A 成分：0.5 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.412 4 g/L MgCl2·6H2O、0.05 g/L CaCl2、0.458 4 g/L K2HPO4·3H2O、0.23 g/L KH2PO4、2.1 g/L 2-溴乙基磺酸钠、10 mL微量元素溶液〔1.5 g/L氨三乙酸、3 g/L MgSO4·H2O、0.5 g/L MnSO4·H2O、1 g/L NaCl、0.1 g/L FeSO4·7H2O、0.1 g/L CaCl2·2H2O、0.1 g/L CoCl2·6H2O、0.13 g/L ZnCl2、0.01 g/L CuSO4·5H2O、0.01 g/L AlK（SO4）2·12H2O、0.01 g/L H3BO3、0.025 g/L Na2MoO4、0.024 g/L NiCl2·6H2O、0.025 g/L Na2WO4·2H2O〕、10 mL 维生素溶液（2 mg/L 维生素H、5 mg/L 维生素B1、10 mg/L 维生素B6、5 mg/L维生素B2、2 mg/L叶酸、5 mg/L烟酸、5 mg/L泛酸、0.1 mg/L 维生素B12、5 mg/L 对氨基苯甲酸、5 mg/L 维生素B14）。

富集培养基B 成分：0.4 g/L NaCl、0.4 g/L NH4Cl、0.272 2 g/L MgCl2·6H2O、0.05 g/L CaCl2、0.25 g/L KCl、0.8 g/Lβ-甘油磷酸钠、2.5 g/L NaHCO3、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L 蛋白胨、10 mL 微量元素溶液（成分同上）、10 mL 维生素溶液（成分同上）。

仪器：HZQ-F100 恒温振荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司；NB-1M 磁力搅拌器，苏州九联科技有限公司；P230Ⅱ高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器公司；Orbitrap Fusion Lumos 三合一高分辨质谱系统（LC-MS），美国ThermoFisher；Sigma 500 场发射扫描电镜，德国Carl Zeiss；Sigma 500 能谱仪，德国Bruker；Ultima ⅣX 射线衍射仪，日本理学。

1.2 实验所用菌种来源

本研究中使用的产乙酸混菌来自实验室成功驯化与富集的高效产乙酸菌群微生物混合培养物。

1.3 微生物-CdS 耦合系统的构建

将产乙酸混菌接种至自养培养基A 中活化培养至OD600达到0.2 后，接种5%（体积分数）菌液至富集培养基B 中，通合成气〔V（H2）/V（CO2）=80/20〕5～10 min 后，放置于恒温振荡培养箱中培养2 d（180 r/min，30 ℃）。微生物富集后，在通合成气的同时加入1 g/L 的L-半胱氨酸盐酸盐和1 mmol/L Cd（NO3）2溶液，混合均匀后继续培养3 d。当菌液由乳白色变为黄色，即表明微生物-CdS 耦合系统成功构建。

1.4 光催化降解实验

产乙酸混菌-CdS 耦合系统离心弃去上清液后重新分散于装有自养培养基A 的厌氧瓶（18 mL）中，补充1 g/L 的L-半胱氨酸盐酸盐，SMX 质量浓度为2 mg/L，反应液体积为10 mL，在模拟光照（白光灯，波长范围为442～447 nm，光照强度为50 mW）条件下，将厌氧瓶放置于磁力搅拌器中启动微生物耦合CdS 光催化降解SMX 实验。用锡箔纸将厌氧瓶包裹3 层以模拟无光照下微生物降解SMX 的实验，将微生物灭菌处理以模拟光催化降解SMX 实验。在反应时间为0、3、6、9、12、24 h 时分别取样0.5 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱仪测定SMX 的浓度，采用液相色谱-质谱联用仪在正负离子模式下检测SMX 的降解产物。

2 结果与讨论

2.1 产乙酸混菌-CdS 耦合系统的合成

产乙酸混菌-CdS 耦合系统的扫描电镜表征结果如图1 所示。

图1 产乙酸混菌-CdS 耦合系统的SEM（a）、（b）和EDS（c）、（d）Fig.1 SEM（a），（b）and EDS（c），（d）of the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS

由图1（a）可见，产乙酸混菌-CdS 耦合系统中存在球形、弧形以及杆状等形态的细菌，这些细菌表面均匀分布着大量球状颗粒。由图1（b）可见，球形颗粒紧密地覆盖在细菌表面。对这些球形颗粒进行EDS 表征，结果如图1（c）、1（d）所示，球状颗粒的主要组成元素为Cd 和S，且比例接近1∶1，初步证实CdS 在产乙酸混菌表面成功合成。

产乙酸混菌-CdS 耦合系统的XRD 分析结果如图2 所示。

图2 中26.58°、43.94°和52.08°处出现3 个峰，分别对应于立方体CdS 的（111）、（220）和（311）面，这与标准卡片PDF#42-1411 一致，再次证实CdS 在产乙酸混菌表面成功合成。X 射线衍射峰宽，说明合成的CdS 晶粒尺寸小〔7-8〕。此外，降解SMX 前后产乙酸混菌-CdS 系统的峰形和峰的位置未发生明显偏移，说明该耦合系统不仅能够有效降解污染物，而且稳定性高。

图2 产乙酸混菌-CdS 耦合系统降解SMX 前后的XRDFig.2 XRD of the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS before and after the degradation of SMX

2.2 产乙酸混菌-CdS 耦合系统对SMX 的去除效果

本研究分别在5 个条件下探究了产乙酸混菌-CdS 耦合系统对SMX 的降解效果：①微生物+CdS；②灭活微生物+CdS；③微生物；④光解；⑤吸附。其中，①、②、④在光照条件下，③、⑤在避光条件下展开研究；④为将SMX 溶解在自养培养基A 中后在光照下的降解。反应时间为24 h。结果见图3。

图3 产乙酸混菌-CdS 耦合系统在不同条件下对SMX 的降解效率Fig.3 Degradation efficiency of SMX in the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS under different conditions

如图3 所示，24 h 内产乙酸混菌-CdS 耦合系统（微生物+CdS）能够完全降解SMX，而微生物单独作用下SMX 的去除率为31%，细菌失活后CdS 光催化剂对SMX 的去除率仅为27%，这初步说明产乙酸混菌在光催化剂降解SMX 过程中发挥了重要作用，产乙酸混菌-CdS 耦合系统显示出优于单独CdS 光催化降解或单独生物降解对SMX 的去除效率。

2.3 CdS 浓度对SMX 降解效果的影响

产乙酸混菌-CdS 耦合系统中CdS 的浓度对SMX 的降解效果和反应速率有显著的影响，结果如图4 所示。

图4 CdS 浓度对SMX 降解效果和反应速率的影响Fig.4 The influence of CdS concentration on the degradation efficiency and reaction rate of SMX

由图4（a）可 见，当CdS浓度分别为0.5、1、2、4 mmol/L 时，虽然SMX 的去除率均随时间的延长而增加，但是相同时间内CdS 浓度越高，SMX 去除率越大。CdS 浓度为2 mmol/L 时，反应12 h 后SMX 的去除率便达到95%；而当CdS 浓度提高为4 mmol/L 时，仅9 h 便能够完全去除SMX。这可能是由于耦合系统中CdS 浓度增加时，水中分散的CdS 光催化剂数量随之增加，微生物自合成的CdS 在光激发下产生的空穴和活性氧等自由基的数量也相应增加〔9〕，耦合系统中微生物的活性得到加强，因此CdS 浓度的增加显著提高了产乙酸混菌-CdS 耦合系统对SMX的降解效果。

此外，由图4（b）可见，SMX 的降解过程均符合一级反应动力学。随着CdS 浓度的增加，反应速率逐渐增加。CdS 浓度从0.5 mmol/L 提高到1 mmol/L时反应速率的增幅较小，这可能是因为CdS 浓度变化较小；当CdS 浓度从1 mmol/L 提高至2 mmol/L 和4 mmol/L 时，反应速率常数从0.123 5 h-1分别提高至0.221 2 h-1和0.359 h-1，说明耦合系统中CdS 浓度的增加显著提高了SMX 降解的反应速率。

2.4 微生物耦合CdS 体系降解SMX 机制研究

为了明确微生物耦合CdS 体系降解SMX 的机制，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）正负离子模式分别对微生物降解、CdS 光催化降解以及微生物耦合CdS 光催化降解SMX 过程中的产物进行检测及对比，从而推导出SMX 可能的微生物降解路径、光催化降解路径以及微生物耦合光催化系统降解途径。

2.4.1 微生物降解路径

微生物降解过程中，在正离子模式下保留时间为4.47 min 处检测到SMX（m/z=254）。依次将正离子模式和负离子模式下检测出的中间产物命名为B-SMX1～B-SMX9，根据代谢产物的结构特点，提出了微生物降解过程中可能的2 种代谢路径，如图5 所示。

有研究表明，细菌体内的2 种Flavin 依赖性单加氧酶（Sad A、Sad B）和FMN 还原酶（Sad C）的基因参与了SMX 的降解过程〔10〕。如图5 所示，在降解途径1 中，SMX 首先被还原为产物B-SMX1（4-苯醌-亚胺）和B-SMX3（3-氨基-5-甲基异唑），之后BSMX1 再被还原为产物B-SMX2（对氨基苯酚），而BSMX3 逐渐失去甲基和氨基，生成产物B-SMX5（异唑）。在降解途径2 中，SMX 结构中的异唑环被破坏，N—O 键断开，生成产物B-SMX6，接着BSMX6 的S—N 键断开生成B-SMX7，B-SMX7 侧链羟基被取代、断裂，最终生成产物B-SMX9（苯胺）。这些产物最终经过微生物的作用可能被完全矿化为SO42-、NH4+、NO3-、CO2、H2O 等。

图5 SMX 在产乙酸混菌作用下的可能降解路径Fig.5 Possible degradation pathways of SMX by the role of homoacetogenic mixed cultures

2.4.2 光催化降解路径

光催化降解过程中，在正离子模式下共检测到9 种产物，依次命名为P-SMX1～P-SMX9。根据降解产物的结构特点，提出了光催化降解SMX 的4 种可能代谢路径，如图6 所示。

图6 SMX 在CdS 光催化作用下的可能降解路径Fig.6 Possible degradation pathways of SMX by the role of CdS photocatalysis

产物的差异可能是由于光催化材料产生的活性基团攻击了SMX 不同的结构位置。在E.IOANNIDOU 等〔11〕的研究中，苯环氨基的羟基化和氧化是SMX 主要的转化途径，有研究推测，O2·-能够将磺胺类化合物结构中的氨基氧化为硝基〔12〕。如图6 所示，在路径1 中，SMX 苯环上的氨基受到攻击，被氧化后形成硝基衍生物P-SMX1。在路径2 中，氨基首先被羟基取代形成产物P-SMX2，之后其异唑环上的甲基受到攻击，形成P-SMX3。而路径3 中SMX 的异唑环直接被强氧化性的羟基自由基等活性基团破坏，形成产物PSMX4。在路径4 中，羟基自由基对磺酰胺键的攻击导致S—N键断裂，直接形成产物P-SMX5和P-SMX6。前3 种路径下P-SMX1、P-SMX3、P-SMX4 这3 种不同的初级产物，在随后的降解过程中S—N 键被打开，形成对氨基苯磺酸的羟基衍生物P-SMX5 和P-SMX6（3-氨基-5-甲基异唑），这2 种产物再经过进一步的氧化还原过程，可能转化为P-SMX7、P-SMX8、P-SMX9这3 种产物。

2.4.3 耦合系统降解路径

产乙酸混菌-CdS 耦合光催化系统在降解SMX 的过程中，不同时间下均检测到光催化降解途径的代谢产物，分别将其命名为H-SMX1～H-SMX9，代谢产物随时间的变化如图7 所示。

图7 微生物耦合光催化系统降解SMX 的降解产物丰度随时间的变化Fig.7 Variation of the abundance of degradation products of SMX with time in the microbial coupled photocatalytic system

由图7 可知，H-SMX1～H-SMX9 的丰度响应值随时间发生变化，其中H-SMX3、H-SMX6、H-SMX9是主要的代谢产物，最终的累积丰度在9 种光催化降解产物中占比最高。结合图6 的光催化降解途径，SMX 苯环上氨基的羟基化、S—N 键的直接断裂以及甲基的丢失可能是耦合光催化系统中SMX 的主要降解途径，SMX 在24 h 内大多被转化为结构较为简单的代谢产物H-SMX9。

图8 为单一光催化系统和耦合光催化系统降解SMX 的中间产物的丰度对比。其中，P 代表单一光催化，H 代表耦合光催化，数字1～9 分别代表代谢产物SMX1～SMX9。

图8 SMX 光催化降解产物丰度在不同条件下随时间的变化Fig. 8 Variation of the abundance of photocatalytic degradation products of SMX with time under different conditions

如图8所示，与耦合光催化系统不同的是，单一光催化降解过程的主要降解产物是P-SMX2、P-SMX3、P-SMX6、P-SMX7、P-SMX9。12 h 内单一光催化体系内P-SMX2 的丰度迅速增加，而耦合光催化系统中H-SMX2 的丰度保持较低水平且增长缓慢。24 h 内H-SMX2 丢失甲基的产物H-SMX3 在耦合光催化系统中的丰度比单一光催化体系增加近2 倍，说明微生物的存在可能促进了异唑环上甲基的去除，使H-SMX2向H-SMX3 转化。此外，产物P-SMX7 在单一光催化体系的降解产物中丰度最高，比耦合光催化系统中H-SMX7的丰度高2个数量级，这可能是由于耦合光催化系统中产乙酸混菌将其转化为更为简单的产物甚至完全矿化为CO2、NH3、H2O 等。作为光催化降解过程的末端产物，反应24 h 时3-氨基异唑（H-SMX9）在耦合光催化系统中的丰度是单一光催化降解产物（PSMX9）丰度的2 倍，这说明耦合系统更利于将SMX 降解为结构简单的代谢产物。

3 结论

通过在细菌表面稳定合成CdS，成功构建了产乙酸混菌-CdS 耦合系统。微生物耦合光催化系统在降解SMX 上的表现优于单一光催化降解或生物降解。提高CdS 浓度能够显著提升SMX 的降解效果和反应速率。微生物耦合CdS 系统在降解SMX时同时存在光催化降解和生物降解过程，微生物降解和CdS 光催化协同促进SMX 转化为结构简单的产物——3-氨基异唑，发挥了生物降解和光催化降解的双重优势。这一系统有望实现PPCPs 污染物的高效降解，探究其对磺胺甲唑的降解机制将为该系统的实际环境应用提供可靠的技术支持，亦可加深研究者对自然界中太阳光驱动作用下矿物与微生物之间相互作用的理论认知。