长寿花叶片愈伤组织诱导及组培技术体系的建立

刘金霞，杨鑫宇，宋丹，张红艳，闫芬芬*

（1塔里木大学园艺与林学学院/南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室，新疆，阿拉尔 843300）

（2昆玉市大漠田园农业发展有限公司，新疆，昆玉 848116）

长寿花(Kalanchoe blossfeldiana)是景天科伽蓝菜属多年生肉质草本花卉，原产马达加斯加岛［1］。其植株矮小，株型紧凑，叶片翠绿、花朵密集、花色丰富，花期从12月开至次年5月，是市场畅销的盆栽观赏花卉［1］。长寿花不仅耐旱性强，养护管理容易，而且应用广泛，装饰效果好，特别适用于微型盆栽及花坛布置等室内外栽培，是新疆乃至西北地区花卉市场的主角，具有良好的市场前景［2］。长寿花传统的繁殖方法有扦插繁殖和播种繁殖，但这些方法繁殖率低，受环境影响大，且容易导致病毒的积累、使品种退化，进而影响长寿花的产量和品质，严重制约种苗的商品化生产［3-4］。采用组织培养的方法不仅可以提高长寿花的繁殖系数，实现规模化生产，而且也可以实现脱毒处理，目前该方法已成为现代化种苗繁育的主要方式［5］。苏惠等［6］利用长寿花的叶柄、茎段和茎尖进行组织培养，并获得相应的培养配方。孙新政等［7］通过对白色长寿花茎段外植体进行了初代诱导、增殖、生根及移栽的研究发现，茎段培养可以作为离体繁殖长寿花的重要途径。高建莉等［8］研究证明以长寿花叶片作为外植体诱导愈伤组织，其诱导时间比用叶柄和茎段短7 d。孙利娜［9］研究得出长寿花嫩叶片的最佳分化培养基为MS+6-BA 3.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，可缩短组培时间。本研究以红色和黄色的重瓣长寿花成熟叶片为外植体，通过离体叶片诱导愈伤途径研究成熟叶片的灭菌处理、叶片愈伤组织、不定芽及不定根的诱导技术。通过离体组织培养的方法繁殖高质量长寿花，提高长寿花繁殖系数，以期建立重瓣长寿花组培技术体系，为西北地区长寿花组培苗工厂化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来自塔里木大学园艺实验站盆栽长寿花成熟叶片，红色品种为‘阿朱诺’，黄色品种为‘日出’。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体灭菌处理

取健壮、成熟的红色和黄色重瓣长寿花叶片，流水冲洗数次，脱脂棉反复擦拭除尘后，在超净工作台内将叶片剪成1.0 cm2正方形小块进行灭菌处理。先用75%乙醇溶液消毒30 s，再加入1%次氯酸钠溶液灭菌处理［10］，其中红色重瓣长寿花叶片分别设置3个灭菌时间处理：6 min、8 min、10 min；黄色重瓣长寿花叶片分别设置3个消毒时间处理：5 min、7 min、9 min。最后无菌水冲洗3次，将灭菌后的叶片切成约1 cm×1 cm的小块接种于MS培养基上，每瓶放置5小块，每个处理接种10瓶，重复50次。7 d后调查污染率、褐化率及叶片诱导状态［11］。

1.2.2 愈伤组织的诱导

将灭菌后1 cm2的成熟叶片接种在不同激素配比的诱导愈伤组织培养基中（表1），每瓶放置5块，每个处理水平接种6瓶，重复30次。25 d后观测并记录愈伤组织生长及增殖的情况。

表1 叶片愈伤组织诱导的激素配比处理 mg/L

1.2.3 不定芽的诱导

将培养28～35 d后生长状况良好的黄绿色愈伤组织切成小块，接种到不同激素配比诱导丛生芽的培养基上（表2），每瓶放置3小块，每个处理水平接种5瓶，重复15次。接种35 d后进行芽增殖系数统计。

表2 不定芽诱导的激素配比处理 mg/L

1.2.4 不定根的诱导

待不定芽生长至2～3 cm时，将健壮的单株芽苗切下转接至不同生根诱导培养基中（表3），每瓶放置3株，每个处理接种5瓶，重复15次，培养室中正常培养。25 d后调查并记录根的生长状况。

表3 不定根诱导的激素配比处理 mg/L

1.3 数据处理

采用WPS Office软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌时间对长寿花叶片灭菌效果的影响

由表4可知，红色重瓣长寿花成熟叶片在1%的次氯酸钠溶液消毒处理时间为10 min时，叶片诱导成功率最高，为64.0%，污染率最低，为26.0%，主要为细菌污染。黄色重瓣长寿花叶片在次氯酸钠灭菌处理9 min时，叶片诱导成活率最高，为60.0%，污染率最低，为28.0%，均为细菌污染。两个花色成熟叶片在1%的次氯酸钠溶液灭菌处理6～7 min时污染率达52%，灭菌时间为5 min时污染率极高，为82.0%。另外，随着灭菌时间增加，叶片褐化程度明显，由于叶片切割材料过小，伤口周围褐化程度较高。因此认为，长寿花成熟叶片最佳的灭菌方式为75%酒精消毒30 s，再用1%的次氯酸钠溶液消毒9～10 min，无菌水冲洗3次为宜。

表4 不同灭菌时间对长寿花叶片灭菌效果及外植体成活率的影响

2.2 不同激素配比对长寿花叶片愈伤组织诱导的影响

由表5可知，不同激素浓度配比对长寿花外植体愈伤组织诱导的能力不同。激素配比为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L时对红色和黄色的重瓣长寿花叶片愈伤组织的诱导效果最佳，红色重瓣长寿花叶片诱导率达到80.0%，叶片形成的愈伤组织状态为向上卷曲膨大、嫩绿色、细密、瘤状的突起，诱导分化明显。黄色重瓣长寿花叶片诱导率为86.7%，在此培养基下，叶片形成的愈伤组织为嫩绿色、细密、有瘤状伤口，诱导分化明显。另外，高浓度的6-BA要比低浓度的诱导效果好，6-BA浓度相同时，高浓度的NAA更利于愈伤组织的形成和分化。

表5 不同激素配比对长寿花外植体愈伤组织诱导的影响

2.3 不同激素配比对愈伤组织诱导不定芽的影响

2.3.1 不同激素配比对长寿花叶片愈伤组织诱导不定芽的影响

由表6可知，不同激素浓度配比对长寿花丛生芽诱导的能力不同，其中MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L为最佳激素配比。在此激素诱导下，长寿花愈伤组织诱导丛生芽的效果最好，其中红色长寿花的增殖系数为2.93，黄色长寿花的增殖系数为2.87，且诱导出的丛生芽多、芽体肥大、长势旺盛，培养后期芽体不会变黄。6-BA浓度相同时，IBA浓度越高，诱导增殖系数越小；IBA浓度相同时，6-BA浓度越高，诱导增殖系数越大，因此认为高浓度的6-BA和低浓度的IBA对丛生芽诱导的效果更好。但是不同浓度的NAA对丛生芽诱导效果的影响不大。两种花色重瓣长寿花在相同激素浓度配比下诱导效果差异不明显，可见不同花色外植体对丛生芽诱导的差异不明显。

表6 不同激素配比对长寿花愈伤组织诱导不定芽的影响

2.3.2 不同诱导时间对丛生芽诱导的影响

在最佳激素配比条件下，诱导时间不同。丛生芽诱导效果不同（图1）。在诱导时间为0～30 d时，A2、A3、A4对丛生芽诱导率均呈上升趋势，但诱导效果存在差异。相同时间下，A2诱导率最高，A3次之，A4最低，因此培养时间小于30 d时，三种激素配比对丛生芽诱导能力为A2＞A3＞A4。诱导时间为30～60 d时，A2丛生芽诱导率呈下降趋势，芽体逐渐由嫩绿色变为黄绿色，个别出现畸形，在培养60 d时大多数已变为淡黄色或者白色。而A4丛生芽诱导率仍呈上升趋势，叶片愈伤组织诱导出的丛生芽颜色一直为绿色的球茎，因此当培养时间大于40 d时，三种激素配比对丛生芽诱导的能力为A4＞A3＞A2。

图1 不同诱导时间对丛生芽影响变化曲线

2.4 不同激素配比对长寿花不定根诱导的影响

由表7可知，不同激素浓度配比对长寿花不定根的诱导率不同。当1/2MS培养基中加入0.3 mg/L的IBA时，长寿花不定根诱导的效果最佳，其中红色重瓣长寿花的诱导率达到80.0%，黄色重瓣长寿花的诱导率达到73.3%。此培养基下诱导出的生根苗粗壮、长势状态好，根长为2～3 cm。NAA浓度相同时，IBA浓度越高，诱导率越高，因此高浓度的IBA有利于根的形成与分化。

表7 不同激素配比对长寿花不定根的诱导

2.5 长寿花叶片不同诱导时期发育动态变化

叶片培养7～14 d后，红花叶片切口处形成白色或淡黄色愈伤组织（图2A），21 d后由淡黄色转变为黄绿色，部分叶片边缘为红色（图2B）。7～14 d黄花叶片切口处形成白色愈伤组织（图2C），21 d后由白色转变为黄绿色，部分为黄白色（图2D）。将已经初步诱导35 d的愈伤组织进行不定芽的诱导分化，接种诱导7 d后，愈伤组织增殖加快并明显由淡黄色转变为黄绿色，部分出现芽点(图2E)，14 d后愈伤组织转变为绿色，芽点陆续分化为绿色小芽（图2F），35 d后形成丛生芽（图2G）。待不定芽生长至2～3 cm时，将健壮的单株芽苗切下转接至生根培养基中，14 d后形成不定根（图2H），25 d后生长为健壮的无性苗（图2I）。

图2 长寿花叶片不同诱导时期发育动态变化

3 讨论

我国是盆栽花卉生产和消费大国，但是多数中高档花卉种苗从国外进口，其中长寿花多从丹麦引进［12］，我国自主育种技术和工厂化育苗体系亟待提高。通过叶片诱导愈伤组织的形成，可实现快速建立组培无性快繁技术体系，提高植物的繁殖系数［13］。在本研究过程中发现，不同花色组织培养快繁技术差异不大，且叶片切割成较小的材料，伤口周围褐化程度较高。通过叶片诱导的愈伤组织为叶片原生质体培养、原生质体融合、遗传转化创造了良好的受体材料，为生物工程技术奠定了理论基础［14］。

植物激素种类和配比对愈伤组织的诱导、不定芽的分化以及不定根的诱导起十分重要的作用。马群等［15］研究发现2,4-D的浓度对诱导芽数的影响较大，当浓度为1.0 mg/L时，诱导的丛生芽芽数多、无失绿现象，而当浓度为1.5 mg/L时，芽数少、有部分失绿现象。本研究发现，高浓度的6-BA和高浓度的NAA更有利于长寿花愈伤组织的形成，6-BA较高时，诱导芽数较高。高浓度的6-BA和低浓度的IBA更有利于丛生芽的诱导，在6-BA 1.0 mg/L和IBA 0.1 mg/L激素配比下，长寿花丛生芽的增殖系数可达2.9，且丛生芽多，芽体肥大，长势旺盛。激素配比为1/2MS+0.3 mg/L时对丛生芽形成不定根的诱导能力最佳，高浓度的IBA有利于不定根的形成与分化。

不同的培养时间对激素的诱导能力存在影响，诱导时间为0～30 d时，高浓度的6-BA和低浓度的IBA更有利于丛生芽的诱导。诱导时间为30～60 d时，在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L培养基条件下丛生芽诱导率呈下降趋势，芽体逐渐由嫩绿色变为黄绿色，个别出现畸形，在培养60 d时大多数芽体已变为淡黄色或者白色。而在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L培养下丛生芽诱导率呈上升趋势，叶片愈伤组织诱导出的丛生芽颜色一直为绿色的球茎，茎段愈伤组织诱导出的丛生芽为黄绿色且后期叶片不发黄，因此培养时间为40～60 d时，高浓度的6-BA和高浓度的IBA更有利于长寿花不定芽的诱导。

4 结论

本研究以成熟叶片为外植体，筛选出用1%的次氯酸钠溶液消毒9～10 min灭菌处理最佳。最佳叶片诱导愈伤组织培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L。最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.3 mg/L。初步通过叶片诱导愈伤组织途径建立长寿花组培快繁技术体系，为后续优良品种快繁和工厂化育苗奠定基础。