基于4-PHF（the four-parameter Hill function)法比较6 种四照花种子的休眠特性

熊 星，鲁 强，王昊伟，杨 玲，洑香香

（南京林业大学南方现代林业协同创新中心/南京林业大学林学院，江苏 南京 210037）

0 引言

【研究意义】四照花属（Cornus）为山茱萸科落叶小乔木或灌木，树种树姿秀丽，夏赏玉花，秋观红果、红叶，集观叶、观花、观果于一身，是具有开发应用前景的园艺观赏树种[1]。四照花包括东亚四照花和北美四照花两大类群[2]，《中国植物志》[3]把两者分开并独立成属，分别命名为东亚四照花属（Dendrobenthamia）和北美四照花属（Cynoxylon）。东亚四照花类群包括10 个种，除日本四照花（亚种中国四照花）和多脉四照花外，其他均为常绿种，分布于喜马拉雅至东亚各地区，我国全有（包括1 种引种栽培的在内），根据Xiang 等[4]的分类系统，东亚四照花类群（Cornus）则被分为5 个种。北美四照花类共有3 个种，均为落叶种，主要分布于加拿大、美国和墨西哥[5]，四照花的自然种群的遗传特征受到其花粉和种子的传播方式影响[6]，北美目前已有超过100 个栽培品种，我国现对其引种、推广栽培也进行相关研究[7-8]。中国作为东亚四照花野生种质资源主要分布的地区，其园艺观赏价值也逐渐受到关注[9]。在种子发芽指标中，发芽率是决定一个种批适合商业使用的重要参数，其他发芽参数也有着重要作用，比如发芽速率影响苗圃出苗的均匀性[10]。当发芽过程符合数学函数时，该函数的参数可用来更好地理解种子的发芽进程和种子预处理对发芽的促进作用。许多曲线拟合函数已经被使用，并对其描述种子发芽过程的适宜性进行了严格的评估[11-13]。采用4-PHF（four-parameter Hill function）对种子萌发进程进行曲线拟合，并对其参数进行生物学解释，可加强对基因型，种批和种子预处理间对发芽差异的理解。【前人研究进展】四照花属种子存在深度休眠，播种后需2年才萌发[14]。根据Baskin的分类方法[15]，四照花种子的休眠类型为生理休眠；用500 mg·L-1赤霉素（GA3）溶液浸泡种子结合低温层积，可有效解除种子休眠，促进种子萌发[16-17]。因四照花属各树种的分布范围较广，不同种的休眠程度存在显著差异[18]。El-Kassaby等[19]提出4-PHF 曲线拟合模型，并将休眠指数（DI）定义为打破种子休眠处理的发芽率的提高，其大小由种子处理前后萌发曲线之间的面积来确定，以此定量估计种子的休眠程度或是种子预处理对解除休眠的效果。具体方法如下：函数通过变形后可获得到种子萌发瞬间速度以及达到最大萌发率的时间，然后通过Richter 和Switzer 积分法[20]对发芽率最高的曲线和未经层积处理的发芽曲线进行积分，求得2 个发芽曲线之间的面积，即休眠指数。【本研究切入点】对四照花类群种子萌发进程进行曲线拟合的相关研究有待深入进行。【拟解决的关键问题】对东亚四照花类群中的中国四照花（C.kousasubsp.chinensis）、秀丽四照花（C.hongdongensissubsp.elegans）、东京四照花（C.hongdongensissubsp.tonkinensis）、香港四照花（C.hongkongensis）、尖叶四照花（C.elliptica），和北美四照花类群中的大花四照花（C.florida）种子DI 值进行估算，并通过积分法定量比较不同种四照花种子休眠程度及预处理对解除休眠的效果，从而探讨不同种四照花种子萌发差异。研究结果可为四照花种质资源保存、种子贮藏及开发利用等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6 种四照花种子均为当年采收后进行发芽试验，采收后搓去果肉，淘洗干净后晾干，于0～4 ℃下保存。种子采集信息如表1。

表1 6 种四照花种子采集信息Table 1 Information on seed collection

1.2 试验方法

1.2.1 种子预处理 浸泡处理：采用500 mg·L-1赤霉素（GA3）溶液浸泡种子3 d，每天更换溶液。

层积处理：将浸泡处理后的种子进行低温层积。种沙体积比为1∶3，湿度控制在手握成团、松手即散的状态，混合均匀后装入打孔的自封袋中，在0～5 ℃的黑暗条件下进行低温层积。设7 个层积时间梯度：0、10、20、30、40、50 和60 d；层积过程中每周搅拌1 次，以保证良好的通气状况；层积期间采用500 mg·L-1GA3溶液保持适宜湿度。

1.2.2 发芽试验 将层积后的种子与湿沙混合置于人工气候室进行发芽试验。发芽测定采用4 个重复，每个重复100 粒种子。发芽温度为25 ℃，每天光照8 h。发芽期间，每天统计发芽种子数量。发芽标准参照《林木种子检验规程》（GB 2772—1999）[21]的规定，发芽持续时间为1 个月，以胚根突破种皮且长度达种子一半为标准统计发芽率。

发芽指标为绝对发芽率：正常发芽的种子总数占供测定的饱满种子总粒数的百分率。

1.3 数据统计分析

1.3.1 四参数希尔方程（4-PHF）利用MATLAB（The MathWorks,Inc.2017），根据4-PHF（1）对种子的累积发芽率进行拟合。其中x和y变量分别为萌发时间（d）和在第x天的累积萌发率（%）。

a—渐近线，即最大累积发芽率，等于发芽能力；

b—控制萌发曲线形状和斜率的数学参数（b越大，斜率越趋向于渐近线a，而从初始发芽至最大发芽经历的时间越短）；

c—为50%的活力种子发芽所需的时间；

y0—y轴截距，用于计算初始发芽时间（lag）。

1.3.2 发芽参数的计算

1）起始萌发时间（lag）：设y=0，求解方程（1）获得方程（2），计算萌发起始时间：

2）种子日萌发率（S）：对方程（1）求一阶导数可得瞬时发芽率曲线方程（3），估计出种子日萌发率，也可以检测萌发速度对其中的任何变量的敏感程度。公式如下：

3）发芽高峰日（TMGR）：将方程（2）绘制成以时间为变量的曲线（4），TMGR 是发芽曲线上达最大时所对应的时间。

4）休眠指数（DI）：对得到发芽率最高的曲线和对照处理的发芽曲线进行积分（5），求得两个发芽曲线之间的面积即DI 值，由下式计算出：

y1、y2分别为休眠解除处理前后同一种批的累积发芽曲线，t0、tn分别为萌发开始和结束时的天数。

2 结果与分析

2.1 层积时间对各种四照花种子休眠解除的影响

种子的绝对发芽率是对种子休眠研究的重要参照指标，可以较直观地衡量解除种子休眠的程度。由图1 可以看出，层积时间对不同四照花种子休眠解除的效果存在显著差异（P＜0.05）。

图1 层积时间对各种四照花种子绝对发芽率的影响Fig. 1 Effect of stratification duration on absolute seed germination percentage of various dogwoods

大花四照花（CF）、中国四照花（CKC）、香港四照花（CH）、尖叶四照花（CE）、东京四照花（CHT）和秀丽四照花（CHE）的最高发芽率分别为89%、78%、71%、54%、69%和63%；值得注意的是，6 种四照花达到最大发芽率所需的层积时间差异很大，分别为60、30、60、50、50 和50 d。造成这种差异的原因一方面可能因种子本身活力差异，如前二者没发芽的种子大部分为腐烂粒；另一方面层积处理未能完全打破种子休眠，如后四者未发芽的种子大部分为新鲜粒。

相比较而言，短时间层积处理对落叶类的大花四照花和中国四照花种子解除休眠效果更为显著，二者层积30 d 时的发芽率分别达78%和75%，已基本解除了种子休眠；而其他4 种常绿类四照花则在层积50～60 d 时才达到最大发芽率，且并没完全解除休眠。由此推测，常绿类四照花种子的休眠程度明显深于落叶四照花种子。

2.2 种子累积发芽率曲线拟合

利用MATLAB 中的曲线拟合程序，以4-PHF（1）为模型进行拟合。拟合参数见表2（P＜0.05）；拟合曲线见图2。

表2 不同层积时间下6 种四照花种子休眠解除的四参数希尔方程（4-PHF）的拟合参数Table 2 4-PHF fitting parameters for dormancy release of dogwood seeds after stratification

从拟合的结果看，发芽率较高的种子，其a值也大；随着层积时间的延长，a值逐渐增大，表明在适合的层积天数范围，层积时间越久，种子发芽能力越强。随层积时间的增加，b值有逐渐变小的趋势。随层积时间增加，c值逐渐减小，说明发芽速度加快了。综上解释表明该函数可用于拟合种子发芽进程，利用该函数的参数可更好地理解种子的发芽行为。

图2 整体拟合效果较好（R2均大于0.99）；除中国四照花种子随着层积时间的延长（＞30 d）累积发芽率下降外，其他5 种四照花基本表现为随层积时间的延长累积发芽率均呈现明显的上升趋势，说明层积有效地促进了四照花种子休眠的解除。大花四照花种子层积30 d 后的累计发芽率与层积60 d 的结果相近（图2-CF），而中国四照花层积30 d 已达到最大值（图2-CKC）；其他四种四照花的情况也很好反映了层积时间对解除休眠的效应。

图2 6 种四照花种子不同层积时间下累积发芽率的4-PHF 拟合曲线Fig. 2 4-PHF fitting curves for cumulative germination rates of dogwood seeds after stratification

2.3 6 种四照花种子萌发的参数比较

2.3.1 lag 与TMGR 将4-PHF 方程（1）的y设为0后，根据方程（2）计算萌发起始时间（lag）与实际的初始萌发时间进行比较（表3）。

由表3 可知，随着层积时间的延长，各种起始萌发时间逐渐缩短。比较未层积处理各种的起始发芽时间，落叶类四照花（CF 和CKC）显著短于常绿类四照花；常绿类四照花则表现为香港四照花及其亚种lag 更长。表明层积可以促使种子提前发芽，且一定时间范围内，层积时间越久，则越快发芽；层积50 d 后，各四照花的lag 值仅为1～3 d。总体而言，计算得出的lag 的理论值要小于实测值2 d 左右，主要原因可能是实际统计发芽的标准是幼苗的基本结构出现时，到达这个阶段所需时间要长于胚根突破种皮的发芽标准，由此看来，理论值和实测值基本相符。

表3 不同层积时间下6 种四照花种子的初始萌发时间（lag）的实际值与理论值Table 3 Actual and theoretical lag of dogwood seeds after stratification

根据方程（3），得到瞬时发芽率曲线（图3）；根据方程（4），可以确定达到最大萌发率的时间，即TMGR。TMGR 表示萌发曲线上的斜率最大时对应的时间点；TMGR 值越小，说明种子预处理对缩短发芽进程产生的影响越明显。

图3 6 种四照花种子不同层积时间下的瞬时萌发率Fig. 3 Instant germination rate of dogwood seeds after stratification

对于大花四照花、中国四照花和秀丽四照花层积TMGR 出现最快均为层积60 d 的处理，分别为2、5.3 和3.3 d；东京四照花、香港四照花和尖叶四照花TMGR 出现最快的为层积50 d 的处理，3.4、7.5 和2.2 d。而最高瞬时发芽率和最快TMGR 相一致的处理出现在CF、CHE、CHT 和CE 上，其余两种CKC 和CH 则有一定的差异。

2.3.2 休眠指数DI 对休眠解除前后的两条4-PHF曲线进行积分，根据方程（4）计算其休眠指数（图4）。

由图4 可知，6 种四照花的DI 值由大到小的顺序为：CF（16.50）＞CHE（13.6）＞CE（10.90）/CKC（10.79）/CH（10.62）/CHT（10.22）。

图4 6 种四照花种子的休眠指数（DI）比较Fig. 4 DIs for seeds of 6 dogwood species

DI 值可以反映层积处理对解除休眠的效果。从数值上来看，层积60 d 基本解除了CF 的种子休眠，其他均存在不同程度的未完全解除休眠的效果，特别是常绿类四照花。DI 值适宜于评价同一树种不同家系和不同种源间种子休眠程度的比较，而对不同树种间评价效果不佳，本研究中的DI 值与发芽率存在一定的差异支持了这个推论（图1、4）。

3 结论与讨论

本研究应用4-PHF 曲线拟合方程比较了层积处理时间对四照花属下6 个种的萌发特性和休眠深度。研究发现6 种四照花种子都不同程度地受到层积处理的影响：均随着层积时间的延长其发芽率呈稳定的上升趋势，但每个种到达最大值的时间存在差异：CKC 仅需30 d，而CF 和CH 则需60 d，其他种则需50 d；同时伴随着其他发芽参数lag（表3）和TMGR（图3）值的稳定下降。通过休眠解除前后积分面积计算获得的休眠指数DI，也随着层积时间的延长也呈增加的趋势（图2），说明层积处理有效地促进了种子休眠解除和种子萌发，类似结果也出现在小干松（Pinus contortavar.latifolia）和白云杉（Picea glauca）种子的萌发上[19]。比较6 种四照花的DI 值也发现，各个种达到最大值所需层积时间存在差异，说明其休眠程度各不相同。CKC 层积30 d就达到最大值，说明其种子的休眠程度较其他种子浅，但与Fu 等[22]的研究结果不一致，这可能与其种子来源不同有关。另外过长时间的层积并不利于CKC 种子的萌发，这种现象在白云杉、圆齿野鸦椿（Euscaphis konishii）和野鸦椿（Euscaphis japonica）种子上也有发现[19,23-24]。

种子休眠在植物中相当普遍，很多植物种子都具有不同程度的休眠，特别是温带和寒带植物[15]。即使是同一树种，因基因型和所处环境的差异，休眠深度在家系间和种源间也存在显著差异[25]，如桃（Prunus persicaL.）[26]、树莓（Rubus idaeusL.）[27]、香果树（Emmenopterys henryiOliv.）[28]等。已有大量研究证明不同生境中种子休眠存在差异，如高温、长日照、干旱环境下以及低纬度地区植物种子具有较低程度休眠[29]。此外，种子休眠程度与植物自身特征（种子大小、种皮厚度和开花时间等）有关，小种子比大种子一般具有更深程度的休眠，种皮厚

度增加会加深休眠程度[30]。前期研究表明，四照花类植物种子存在一定程度的生理休眠，采用500 mg·L-1GA3溶液浸泡种子3 d 后进行低温层积30～60 d 即可打破休眠[22]。由于6 种四照花的适生区域各不相同，而有的树种的分布范围很大，从而产生了不同的休眠特性以适应相应的环境。

利用4-PHF（four-parameter Hill function）描述种子累计发芽进程，该函数的4 个参数可以对发芽进程和种子预处理对促进发芽的影响进行直接或间接生物学解释。种子发芽参数受种子本身遗传特性和外界环境的影响具有多样性，发芽参数有助于估计种子到幼苗的转化率，从而评估该种子是否适合商业化育苗，发芽参数也有助于评价种子预处理（尤其是解除休眠）和苗圃经营措施的效果[31]。本研究中所得的发芽参数是用4-PHF 拟合曲线的产物，此曲线拟合方法也被用于评价种子预处理和比较种批间的差异[32]，El-Kassaby 等[19]就应用4-PHF 来评价小干松和白云杉种子的萌发特性，并从生物学角度诠释了基因型、种批和预处理间的萌发差异。本文用此方法比较不同预处理对四照花属下各种间种子的萌发差异，发现采用此方程所计算的各萌发参数lag 和TMGR 值比仅用发芽率更合理地反映种子的发芽能力；而DI 值反映了层积处理对解除休眠的效果，但种间休眠程度的比较效果不佳。在运用DI 值反映休眠程度时，因为不同种植物打破休眠的处理有差异，发芽曲线需对没有预处理的发芽曲线（对照组）与完全打破其休眠的发芽曲线进行积分，而统一处理进行比较效果不明显。总体来看，本研究结果对四照花种苗生产具有科学的指导意义，对其他种子萌发进行数学表示和发芽参数提取具有借鉴意义。