高表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯茶树种质资源的筛选与评价

陈潇敏，金 珊，吴文晞，邵淑贤，王淑燕，王鹏杰，赵 峰，叶乃兴

（1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002；2.福建恒正检测技术有限公司，福建 福州 350100；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

0 引言

【研究意义】儿茶素类化合物具有抗衰老、抗炎症、抗菌、抗病毒及抗氧化等功效[1-2]，是茶叶生物化学研究最广泛、最深入的一类物质。儿茶素类主要包括表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），其中，EGCG 抗氧化性最为突出[3-4]。表没食子儿茶素-3-O（3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me）是在20 世纪末从茶叶中新发现的一种天然被修饰的儿茶素物质，相较于其他常见的EGCG、EGC、ECG 和EC，它的抗过敏和消炎等药理作用更强，尤其是花粉过敏反应的抑制效果极佳[5]。福建省为我国最大产茶省，茶树栽培历史悠久，野生茶树种质资源尤其丰富[6-8]。对福建野生茶树资源进行系统全面的儿茶素组分测定及分析，筛选出高EGCG、高EGCG3″Me 等特异资源，对福建野生茶树资源的高效利用与甲基化儿茶素的研究具有重要意义。【前人研究进展】近年的研究发现，EGCG 经甲基化、酰基化、糖苷化修饰后，其消炎、抗过敏性等药理作用会被显著提高[9-12]。日本学者研究显示红富贵、红富士和红誉这3 个茶树品种中EGCG3″Me 含量可超过1%[13]。近年来，我国茶叶科技工作者也通过筛选，发现了一系列含有此类甲基化儿茶素的种质资源[14-15]。例如，Jin 等[6]在福建省南部发现一类白芽茶富含EGCG3″Me，陈潇敏等[16-17]对福建省大田、云霄茶树品种资源进行生化成分分析，发现两地的茶树品种资源均含有EGCG3″Me，并筛选出儿茶素组分特异资源。【本研究切入点】本课题组在福建省境内不同区域共收集获得43 份野生茶树资源，已对其嘌呤生物碱组分进行测定及系统分析[18]，其儿茶素组分则有待进一步研究。【拟解决的关键问题】本研究通过对课题组在福建省云霄、大田等7 个县（市、区）搜集到的43 份野生茶树种质资源儿茶素组分的系统分析，进而筛选获得其中高EGCG、高EGCG3″Me 的特异茶树种质，旨在为高功能成分茶树品种选育和高EGCG、高EGCG3″Me 产品的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以43 份福建野生茶树资源和8 个主要栽培品种，共51 份种质资源为供试茶样。43 份福建野生茶树资源样品（野生茶）采集自福建云霄、大田、尤溪、蕉城、诏安、漳平以及安溪等7 个产区，8 个常规生产栽培品种分别为福鼎大白茶、福云6 号、黄旦、黄观音、黄金芽、龙井43、白叶1 号及嘉茗1 号，均采集自武夷学院茶树种质资源圃（北纬27°44′20″，东经117°59′51″）。供试材料信息见表1。采集过程参照《茶树种质资源描述规范和数据标准》[19]，于2021 年采摘春季第1 轮茶树新梢的一芽二叶，冷冻干燥后粉碎过60 目筛。

表1 供试茶树种质资源信息Table 1 Information on tea germplasms

1.2 标准品与试剂

表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methylgallate),EGCG3″Me]、儿茶素（Catechin，C）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechingallicacid，EGCG）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechingallate，ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（Callocatechingallate,GCG）、儿茶素没食子酸酯（Catechingallate，CG）标样（纯度≥98%，上海，源叶生物科技有限公司），甲醇（色谱级，上海默克化工技术有限公司），甲酸（色谱级，中国国药集团化学试剂有限公司），水为超纯水。

1.3 仪器设备

UltiMate 3000 高效液相色谱仪（美国，赛默飞世尔科技公司），二级管阵列检测器（DAD），C18反相色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（中国，广州菲罗门公司）；AB204-N 分析天平（美国，梅特勒公司）；超纯水系统（中国，Medium Touch，上海和泰仪器有限公司）。KQ-800E 型超声波清洗器（中国，昆山市超声仪器有限公司）；MS3 basic 涡旋振荡仪[中国，艾卡（广州）仪器有限公司]。

1.4 儿茶素组分测定

参照王丽丽等[20]的高效液相色谱法。前处理：称取0.200 g 粉碎样（过100 目筛），加30 mL 甲醇，涡旋，室温下超声提取30 min，4 ℃，10 000 r·min-1冷冻离心5 min，上清液过0.22 μm 有机相微孔滤膜。色谱条件：流动相A 为0.2%甲酸-水溶液（V∶V），流动相B 为甲醇；流速1.00 mL·min-1；柱温，40 ℃；进样量10 μL。梯度洗脱条件，0～2 min，88% A；2～10 min，88%～75% A；10～15 min，75%～73% A；15～25 min，73%～68% A；25～30 min，68% A；30～32 min，68%～88% A。检测器波长280 nm。

1.5 数据处理

每个参试资源品种，分别采集3 批次，测定后，以“平均值±标准偏差”表示其儿茶素组分含量；使用Microsoft Excle 2018（美国，Microsoft 公司）进行数据处理及表格制作；以Origin 2018（美国，OriginLab 公司）制作折线图；采用SIMCA P14.1软件（瑞典，Umetrics AB 公司）进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。使用MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca.）在线分析平台进行聚类热图的绘制。儿茶素总量（Total catechins，TC）=EGCG3 ″Me+ECG+EGCG+GCG+CG+C+GC+EGC+EC。

2 结果与分析

2.1 福建野生茶树资源儿茶素组分含量分析

通过对43 份福建野生茶树资源儿茶素组分进行基本的统计分析，9 种儿茶素组分标准品及样品的液相色谱图见图1，统计结果见表2，表明茶样中EGCG含量均为最高，YX06、ZP01中则富含EGCG3″Me；GCG、CG、GC 在供试样中含量均较低或未检出。

表2 43 份福建野生茶树资源及8 个栽培品种儿茶素组分含量Table 2 Catechins in 43 wild tea germplasms in Fujian and 8 cultivated varieties （单位：mg·g-1）

图1 标准品及参试样品的色谱Fig. 1 Chromatograms of standards and test samples

对43 份福建野生茶树资源及8 个栽培品种儿茶素组分含量进行描述统计分析，结果见表3，从儿茶素组分的构成上看，43 份福建野生茶树资源与8 个栽培品种相同，是以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为主要组分，均未检测到儿茶素没食子酸酯（CG），含有少量的没食子儿茶素（GC）和没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）。与栽培品种不同的是，在43 份福建野生茶树资源中，均检出表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me），其中以云霄6 号（YX06）含量最高，为33.65 mg·g-1，而在栽培品种中，金观音（JGY）和黄旦（HD）含有少量的表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me），其余栽培品种均未检测该物质。可见，福建野生茶树资源富含表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me）。

以43 份福建野生茶树资源和8 个栽培品种儿茶素各组分含量的平均值为数据，绘制柱状图并进行t检验，结果如图2 所示。福建野生茶树资源与栽培品种在非酯型儿茶素含量中均无明显差异，其中，福建野生茶树资源的没食子儿茶素（GC）和儿茶素（C）含量略高于栽培品种，而表没食子儿茶素（EGC）和表儿茶素（EC）含量略低于栽培品种。福建野生茶树资源的酯型儿茶素含量均高于栽培品种，其中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me）极显著高于栽培品种。

图2 供试资源儿茶素组分含量Fig. 2 Content of tea germplasms in catechin components

2.2 正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA)

对福建野生茶树资源和栽培品种的儿茶素组分进行OPLS-DA 分析。在图3-A 中，除了漳平11 号（ZP11）以外，其余福建野生茶树资源与栽培品种可以较好区分。其中福建野生茶树资源与栽培品种金观音（JGY）、黄旦（HD）、福鼎大白茶（FD）距离较近，与栽培品种龙井43（LJ43）、白叶1 号（BY1）、嘉茗1 号（JM1）、黄金芽（HJY）距离较远。由图3-B 可知，福建野生茶树资源的主要标志物为表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），栽培品种含量较高的为表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素（EC）。如图3-C 所示，共有4 种化合物的 VIP (Variable importance for the projection，VIP)值大于1，变量VIP 值由高至低依次是表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、儿茶素（C）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）和没食子儿茶素（GC）。此外，VIP 大于1 的4 种化合物在因子载荷图（图3-B）中均属于离两类资源较近的变量。

图3 43 份福建野生茶树资源及8 个栽培品种儿茶素组分的OPLS-DA 分析Fig. 3 OPLS-DA statistical analysis on catechins in 43 wild tea germplasms in Fujian and 8 cultivated varieties

2.3 聚类热图可视化分析

为直观展示儿茶素组分在福建野生茶树资源及栽培品种间的差异，对所测数据进行聚类热图可视化分析，颜色偏向红色说明含量越高。如图4 所示，43 份福建野生茶树资源中有12 份与栽培品种聚为A 类，以诏安和蕉城地区的种质居多。其中，蕉城地区的3 份种质的儿茶素组分含量与栽培品种最为接近，如图中区域1 所示，其表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）和儿茶素（C）含量较高，而其他物质含量均较低。B 类为剩余的31 份福建野生茶树资源，其与栽培品种具有明显的区分，如图中区域2 所示，其表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基）没食子酸酯（EGCG3″Me）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量较高。

图4 43 份福建野生茶树资源及8 个栽培品种儿茶素组分聚类热图可视化分析Fig. 4 Heatmap analysis on catechins in 43 wild tea germplasms in Fujian and 8 cultivated varieties

2.4 特异性福建野生茶树资源筛选

根据儿茶素组分测定结果，参照王新超[21]的茶树特异资源筛选指标，从43 份福建野生茶树资源中筛选出一批在儿茶素组分上比较特异的资源，包括18 份高儿茶素茶树资源，9 份高EGCG 茶树资源，8 份高EGCG3″Me 茶树资源（表3），这些特异资源可以作为育种亲本用于之后的育种研究。

表3 福建野生茶树特异资源的筛选Table 3 Selection of tea germplasms from wild resources found in Fujian

3 讨论与结论

儿茶素组分是茶树次生物质代谢产物的重要成分，对茶叶的色、香、味品质的形成有重要作用[3]。鉴定茶树种质资源中的儿茶素组分含量及分布特征，对有针对性地开发利用资源具有重要意义。儿茶素组分又可划分为酯型儿茶素与非酯型儿茶素（简单儿茶素），其与茶叶滋味、茶叶保健功效密切相关。酯型儿茶素较非酯型儿茶素苦涩味更重，抗氧化效果更加突出[22]。本研究结果表明，在福建野生茶树品种资源中，酯型儿茶素的含量均高于栽培品种，其中EGCG 和EGCG3″Me 含量极显著高于栽培品种。此外，通过正交偏最小二乘判别分析及聚类热图分析发现，福建野生茶树品种资源与栽培品种的主要差异物质为EGCG 和EGCG3″Me，这与前人的研究结果相似[15,23]。从产区之间分析发现，蕉城地区与栽培品种聚为A 类，其EGCG3″Me、ECG、EGCG 均较低，但EGC 和EC 含量较高。尤溪汤川、安溪及漳平地区的茶树品种资源聚为B 类，该类群各儿茶素组分含量均较高，特别是EGCG3″Me、ECG、EGCG 含量。而诏安、云霄及大田野生茶树在A、B 两类均有分布，不同茶树种质资源间儿茶素含量变化较大，无明显区域特征。由此可见，福建野生茶树品种资源富含丰富的EGCG 和EGCG3″Me，具有较高的开发利用价值。

EGCG3″Me 是EGCG 甲基化产物，也是茶叶中最为常见的一种甲基化儿茶素，相比于EGCG，具有更强的抗氧化和抗衰老等保健功效[5]。茶叶中EGCG3″Me的含量因茶树种质的不同有很大差异，并且高含量EGCG3″Me 茶树种质资源的分布具有一定的区域性特征[24]。吕海鹏等[24]对国内200 多份高茶多酚茶树种质展开调研，发现在福建、广东两地具有较多含有EGCG3″Me 的茶树种质。本研究中的43 份福建野生茶树种质资源中均检测出EGCG3″Me，其中含量大于10 mg·g-1有24 份资源，大于20 mg·g-1有8 份资源，含量最高的为云霄6 号（33.65 mg·g-1）。随着茶学领域的研究进入后基因组时代，茶树次生物的代谢机理也逐渐深入到分子层面的研究阶段[25-26]。但对于茶树甲基化EGCG 形成机理的研究因缺少富含EGCG3″Me 的试验材料而严重受阻[13]，而此次筛选鉴定出富含EGCG3″Me 的种质资源，将为茶树高甲基化EGCG 形成机理研究以及发掘茶树特异种质资源提供试验材料。

福建野生茶树种质资源丰富，对其儿茶素组分构成进行系统性评估，并从中筛选出高儿茶素茶树资源（＞200 mg·g-1）18 份，高EGCG茶树资源（＞150 mg·g-1）9 份，高EGCG3″Me茶树资源（＞20 mg·g-1）8 份，为优异茶树种质资源的开发利用提供依据。