离蕊金花茶花粉活力测定、培养基筛选及贮藏研究

陈菊艳， 邓伦秀， 黄郎， 徐超然， 刘晓慧

(贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005)

金花茶组(Camelliasect.nitidissima chang)植物属于山茶科(Theceae)山茶属(Camellia)，是我国及世界珍稀物种，已被列入国家Ⅱ级保护植物和《国际生物多样性公约》附属Ⅱ物种[5]。其花色呈金黄色，微芳香，观赏性极高，除此之外，金花茶的花具有抗癌、抗衰老、降低胆固醇和提高机体免疫力等功能，是传统的中药材[6]，可制成茶叶和保健品，一些种已被开发成花茶，且售价昂贵，市场供不应求[7]，具有较高的药用、观赏和经济价值，开发利用价值极高。多数种类分布区域狭窄，野外资源稀少，花和果实易遭虫害，限制了金花茶的开发利用，且被列为濒危植物[7]。离蕊金花茶(Camellialiberofilamenta)[1-4]是金花茶组的物种之一，是唯一分布于贵州的金花茶组的植物，目前，对离蕊金花茶的研究主要集中在形态解剖与分类、种苗繁育、代用茶等方面，对其花粉贮藏特性研究尚未有报道。对离蕊金花茶花粉生活力及花粉贮藏条件进行相关研究，可有效解决花期不遇、远距离杂交等林木遗传问题[8]。本试验以离蕊金花茶花粉为材料，对其活力测定方法、花粉培育基和贮藏条件进行研究，为该种的杂交育种及其花粉资源保存等研究提供一定参考和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

离蕊金花茶生长在林下、沟边或沟两侧斜坡上(24°40＇40″N、106°00＇14″E，海拔620～720 m)。观察研究的群体于1995年采集种子引种到贵州省林业科学研究院，播种育苗后栽培于阔叶林林下，现已经开花结果10余年，并且无性繁殖苗也已经开花结果。选取种群中发育正常、长势较好、具代表性的离蕊金花茶各7株为研究对象，进行编号、挂牌、定位，观测其开花情况。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉收集方法

在同一时间随机选取发育程度相同而又处在不同状态下的花，分为花苞待开、花开一半、完全盛开、盛开后1 d、盛开后2 d等5个不同的花期，每个花期各选5朵进行花粉采集，在早上9点以前采集当天开放的花朵装入硫酸纸袋中，放入25～30 ℃的室内阴干，待花药大量爆裂之后收集花粉，将采集的花粉混合均匀后，装入加有干燥硅胶的小玻璃瓶中，及时染色后测定其活力。

1.2.2 花粉活力测定方法

本试验采用I2-KI染色法[9]、TTC染色法[9]、花粉萌发法[10]进行花粉活力测定(以花粉萌发率为测定标准)，其中前两种方法为花粉活力的快速测定法。

3种检测方法置于低倍显微镜下，观测视野中总花粉粒及显红色(粉红色)花粉粒数目，每样做3个平行玻片，每玻片选取5个花粉粒分布均匀且花粉粒数目不少于50粒的视野进行统计。凡被染成红色的花粉，其活力强视为可育花粉，淡红色次之，无色为没有活力或不育花粉。

花粉活力百分比=可育花粉粒数/观察花粉粒总数×100%。

1.2.3 不同培养基中花粉的萌发率测定

按试验设计(表1)配置液体培养基，选取TTC检测活力最高时期的花粉，用不同液体培养基进行液体培养检测花粉活力。将液体培养基取一滴滴至凹槽载玻片上，将花粉蘸取到液体培养基上，置于28 ℃条件下培养4 h后，在显微镜下观察，花粉管长出并超过花粉粒直径记为有活力，花粉管没有长出或虽然长出但没有超过花粉粒直径大小则记为无活力，统计花粉萌发率，花粉萌发率=(已发芽的花粉数/花粉粒总数)×100%。

表1 花粉萌发率试验设计

1.2.4 不同贮藏条件花粉的萌发率

将花粉活力最好时期的花粉，分别保存在-20 ℃、4 ℃和常温的条件下，之后，将花粉均匀涂抹在固体培养基上进行培养，在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、10 d、15 d、30 d、50 d分别测定各个贮藏条件下的花粉萌发率。

1.3 数据分析

使用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析，通过Duncan检验进行差异显著分析(p<0.05)，图表采用Excel进行制作。

2 结果与分析

2.1 不同测定方法测定花粉活力

TTC染色法和I2-KI染色法测定的离蕊金花茶花粉萌发率明显高于花粉萌发法，差异达到极显著水平(表2)。I2-KI法和TTC法染色后的花粉粒部分为红色，表明花粉活力很强，部分为粉色，表明花粉活力一般，还有一部分为白色，表明花粉失活，因此，I2-KI法和TTC法都可以用于离蕊金花茶花粉活力的测定。

表2 不同测定方法下花粉萌发率(%)

2.2 不同发育时期离蕊金花茶花粉活力

花粉具有活性是保证植物能正常授粉受精的关键和基本前提，较高的花粉存活率具有较高的萌发率，可为离蕊金花茶传粉结实提供可育的雄配子。离蕊金花茶一般在10月中下旬进入盛花期，每朵花的花期约4～6 d，不同时期开花状态见图1，利用TTC法对5个不同时期花粉活力进行简单快速测定，结果见表3，不同花期状态下，离蕊金花茶的花粉存活率差异显著。花蕾期，离蕊金花茶花粉活力仅0.53%；雄蕊初露期花粉活力逐渐升高，平均值54.95%；花瓣展开期即开花初期，花粉活力迅速上升，平均值达94.64%；在花朵完全盛开时活力最强，平均值达96.17%；随后呈现出降低的趋势，枯萎凋谢期即在花朵完全盛开1 d后，此时花粉逐渐散去，但仍然保持较高活力，平均值达到83.60%。总的来说，离蕊金花茶花粉存活率均随距离花朵完全盛开时间的增加而呈现为先上升后下降的趋势，即花粉存活率随花朵距离完全开放的时间越近花粉活力越高，待花朵完全开放1 d后，花粉存活率开始呈现出逐渐下降的趋势，表明离蕊金花茶花朵完全盛开至1 d内，其花粉能保持较高的存活率。同时，这个阶段也是昆虫开展传粉最佳时期，说明花粉活力与单花发育进程密切相关。

表3 不同开花时期花粉活力

图1 不同时期开花状态

2.3 不同培养基对花粉萌发率的影响

对添加有不同质量浓度硼酸与蔗糖的培养基上离蕊金花茶花粉萌发情况进行观测，结果见表4。从表中可以看出，不同质量浓度的硼酸和蔗糖处理均能促进花粉的萌发，在7号处理中花粉萌发率为63.88%，极显著高于3号、6号处理，与其他各处理间差异则不显著。从表5方差分析结果可见，不同质量分数硼酸与蔗糖的培养基对实验结果有显著性影响(P<0.05)。经不同培养基筛选，以7号液体培养基的花粉活力最高，说明7号培养基最适合作为离蕊金花茶花粉活力的检测，培养基配比为1%琼脂+100 mg/L硼酸+200 g/L蔗糖。

表4 不同液体培养基下花粉萌发率

续表4 不同液体培养基下花粉萌发率

表5 不同花粉培养基上的花粉萌发情况的方差分析

2.4 不同贮藏条件对花粉活力的影响

由表6可以看出，常温环境下，离蕊金花茶花粉贮藏2 d后花粉活力下降为50.13%，贮藏10 d后花粉活力为0.56%，贮藏15 d后活力为0，最先失去活力，花粉活力下降最快；4 ℃贮藏条件下，离蕊金花茶花粉贮藏4 d后活力下降到44.78%，贮藏15 d后花粉活力为5.63%，30 d后活力为0；在-20 ℃贮藏条件下，前期离蕊金花茶花粉萌发率下降速率较缓，表明在这种条件下，有利于离蕊金花茶花粉短期贮藏，贮藏30 d后活力仍然保持在8.27%，一直到贮藏50 d后才失去活力。

表6 不同贮藏方法下花粉活力

续表6 不同贮藏方法下花粉活力

由以上结果可初步得出，在-20 ℃冷冻条件下离蕊金花茶的花粉能贮藏更长的时间，在1个月左右，有利于进行离蕊金花茶的远缘杂交。

3 讨论与结论

花粉活力的研究为杂交育种过程中选配优良授粉品种和解决雌雄花期不遇提供重要依据，其中花粉活力高是授粉成功的重要保证。花粉活力鉴定方法目前有两类，即染色法与离体萌发法[11]，染色法因具有操作简单、方便快速，无需特别的外界辅助条件的特点，能在短时间内测定花粉活力，但结果受内外多种因素影响较大。离体萌发法判断花粉生活力的标准为观察是否有花粉管萌发，其更为直观，但需要摸索离体萌发的最佳培养条件，因此不同植物花粉生活力的测定只能选用特定的方法[12]。本研究中离蕊金花茶花粉活力测定所选择的I2-KI染色法、TTC染色法，测定结果均比花粉萌发法理想得多，因而这两种测定方法可以作为离蕊金花茶花粉活力快速检测的方法。

确定花粉的最佳采集期，以保证其最高水平的成熟度，是决定贮藏后花粉活力能否保持较高水平以及后续杂交育种能否成功的关键[13]。选用花粉活力高的花粉作为父本可有效提高种子的产量与质量，并为种子园配置及更新提供理论依据。本研究发现花瓣展开期和盛花期花粉活力最高，因此，在离蕊金花茶人工授粉时，建议选择花瓣展开期和盛花期的花朵采集花粉，随采随授，即离蕊金花茶在开花前1d和开花当天采摘花粉活力较高的雄蕊后，立即取下花粉，采用合适的工具尽快授粉，以提高授粉率。

本试验中，1%琼脂+100 mg/L硼酸+200 g/L蔗糖的离蕊金花茶花粉培养基培养的花粉萌发率最高，达到63.88%，远远高于3号、6号处理，也高于1号、2号、4号、5号、8号、9号处理，在9个培养基中最适合离蕊金花茶花粉萌发。研究发现，不同浓度蔗糖的花粉培养基培养离蕊金花茶花粉萌发率是不同的，200 g/L蔗糖有利于花粉的萌发，是否更高浓度蔗糖对离蕊金花茶花粉萌发效果更好，有待进一步研究。硼元素在植物花期对花药成熟和花粉管萌发有很重要的辅助作用，可以促进糖的吸收代谢，在一定程度上影响关键酶活性，改变细胞壁延展性以致影响花粉管细胞壁的构建[14]。当蔗糖浓度相同时，随硼酸浓度升高花粉活力依次下降，可见硼酸发挥作用需要适宜的蔗糖浓度，两者存在交互作用，而蔗糖的浓度影响占主导地位，这与顾亚东等[15]和胡新军等[16]的研究结果一致。

花粉能够保持受精时间长度的能力被称为花粉活力，它受到内因与外因的影响，其中温度变化和贮藏时间是影响花粉活力的重要外因[17-19]。温度变化和贮藏时间对花粉生活力有影响，不同温度作用下可促进花粉萌发或延长花粉贮藏时间，在低温状态下贮藏植物花粉，活力降低会相对缓慢，贮藏时间越长，花粉活力则越容易降低[20-22]。由实验结果可知，离蕊金花茶花粉贮藏在-20 ℃温度条件下可适当延长花粉生活力，保存时间在1个月左右，这为解决育种授粉活动中有关花期不遇的问题提供了有价值的参考。

综上，本实验研究了离蕊金花茶花粉活力测定的方法、在不同培养基上的萌发表现以及在三种贮藏温度下的活力对比，可为指导离蕊金花茶种子园的营建、花粉管理、种质创新利用等提供科学依据。在此基础上，进一步的研究方向为离蕊金花茶与其他种间杂交组合的亲合度及对座果率、种子质量的影响。