真性红细胞增多症患者外周血JAK/STAT信号通路中关键因子表达意义

康虹阳 刘洁 陈哲 吉慧姝 李琦 张斌 佟长青

真性红细胞增多症是一种造血干细胞的慢性克隆性骨髓增殖性疾病，起病隐匿、病情进展缓慢，以全血总容量、红细胞容量及血液黏滞度增高为主要特征，极易并发血栓栓塞事件，严重威胁患者生命安全［1-3］。因此，及时诊断真性红细胞增多症，并预测其并发症发生尤为关键。近年来，研究发现，绝大多数真性红细胞增多症患者存在JAK2基因V617F 突变，该突变可激活JAK2蛋白，致使其异常活化，进而使JAK2 下游信号转导及激活因子（STAT）磷酸化，造成Janus 激酶/信号转导与转录激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路持续活化，致使血细胞增殖失控［4-5］。本研究通过观察真性红细胞增多症患者外周血JAK/STAT信号通路中关键因子JAK1、STAT3、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA 表达，探究其临床意义，旨在为该病诊疗提供参考依据。报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年1月至2019年1月河北北方学院附属第一医院80 例真性红细胞增多症患者作为观察组，男42 例，女38 例，年龄平均（45.56±9.12）岁；随机选取同期健康体检者35 例作为对照组，男18例，女17 例，年龄平均（46.16±9.87）岁。两组性别、年龄等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，所有受试者知情同意，并签订同意书。

观察组纳入标准：①均符合真性红细胞增多症相关诊断标准［6］，均为初诊患者；②健康体检者各项体检指标均正常。排除标准：①继发性或相对性红细胞增多症者；②合并免疫系统疾病者；③伴有感染性疾病者；④合并恶性肿瘤者；⑤伴有其他血液系统疾病者；⑥既往血栓者。

1.2 方法

入院后，受试者均于清晨空腹状态下抽取5 mL 外周静脉血，高速离心处理后，保存于-80℃冰箱内待检；以Trizol 法获取血清总RNA，分光度测其纯度及浓度，将RNA 反转录为cDNA；采用实时荧光定量PCR，内参基因选择U6基因，采用华大基因合成JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α 引物序列，进行qRT-PCR 反应，试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司，采用2-ΔΔCt方法计算JAK1、STAT3、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死 因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA 表达。

随访时间截止至2022年1月，统计血栓事件发生情况及无血栓事件进展的总生存率，并将随访（36 个月）维持的65 例患者分别按照JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达的不同，分为高JAK1mRNA 组（JAK1mRNA≥4.06）与低JAK1mRNA 组（JAK1mRNA＜4.06）、高STAT3mRNA 组（STAT3mRNA≥6.27）与低STAT3mRNA 组（STAT3mRNA＜6.27）、高IL-6mRNA 组（IL-6mRNA≥4.79）与低IL-6mRNA 组（IL-6mRNA＜4.79）、高TNF-α mRNA 组（TNF-α mRNA≥3.82）与低TNF-α mRNA 组（TNF-α mRNA＜3.82）。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计量资料用（±s）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用SNK-q 检验，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料用n（%）表示，χ2检验；预测价值用受试者工作特征（ROC）曲线分析；生存情况用卡普兰-迈耶（K-M）评价。P＜0.05 表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血JAK/STAT 信号通路中关键因子mRNA 表达水平比较

观察组JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达均较对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组外周血JAK/STAT 信号通路中关键因子mRNA表达比较（±s）Table 1 Comparison of mRNA expression of key factors in JAK/STAT signal pathway in peripheral blood between the two groups（±s）

表1 两组外周血JAK/STAT 信号通路中关键因子mRNA表达比较（±s）Table 1 Comparison of mRNA expression of key factors in JAK/STAT signal pathway in peripheral blood between the two groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 80 35 JAK1 4.06±1.26 1.25±0.37 12.924 0.000 STAT3 6.27±1.41 1.28±0.32 20.657 0.000 IL-6 4.79±1.25 2.52±0.49 10.379 0.000 TNF-α 3.82±1.07 2.04±0.62 9.177 0.000

2.2 不同临床资料患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA表达

不同性别、年龄患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），不同白细胞计数、中性粒细胞百分比及C 反应蛋白水平患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同临床资料患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达比较（±s）Table 2 Jak1，STAT3，IL-6 and TNF-α in patients with different clinical data-α MRNA expression comparison（±s）

表2 不同临床资料患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达比较（±s）Table 2 Jak1，STAT3，IL-6 and TNF-α in patients with different clinical data-α MRNA expression comparison（±s）

项目性别n JAK1 STAT3 IL-6 TNF-α男女42 38 t 值P 值年龄＜60 岁≥60 岁t 值P 值白细胞计数≤10×109/L＞10×109/L t 值P 值中性粒细胞百分比55%～70%＞70%t 值P 值C 反应蛋白≤8 mg/L＞8 mg/L t 值P 值4.05±1.25 4.07±1.27 0.071 0.944 6.25±1.35 6.29±1.47 0.127 0.899 4.70±1.31 4.89±1.29 0.653 0.516 3.79±1.10 3.85±1.05 0.249 0.804 49 31 4.02±1.31 4.12±1.28 0.336 0.738 6.20±1.31 6.38±1.27 0.606 0.546 4.65±1.36 5.01±1.50 1.108 0.271 3.76±1.11 3.91±1.29 0.515 0.608 27 53 3.49±1.02 4.35±1.40 3.174 0.002 5.58±1.16 6.62±1.35 3.410 0.001 4.20±0.98 5.09±1.26 3.206 0.002 3.19±0.84 4.14±1.12 3.882 0.000 16 64 3.42±1.12 4.22±1.25 2.334 0.022 5.55±1.41 6.45±1.62 2.036 0.045 4.27±0.87 4.92±1.05 2.285 0.025 3.02±0.82 4.02±1.06 3.514 0.001 21 59 3.69±0.54 4.19±0.95 2.278 0.025 5.71±1.31 6.47±1.50 2.058 0.043 4.26±1.03 4.98±1.24 2.382 0.020 3.12±0.85 4.07±1.22 3.289 0.002

2.3 外周血JAK/STAT 信号通路中关键因子表达对真性红细胞增多症的诊断价值

以观察组作为阳性样本，对照组作为阴性样本，绘制ROC 曲线，结果显示，JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 诊断真性红细胞增多症的AUC 分别为0.755、0.783、0.773、0.730，联合预测AUC 为0.916，较各指标单独预测价值明显提高（DeLong=12.784，P＜0.001），其诊断敏感度为85.00%，特异度为91.43%。见表3、图1。

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

表3 外周血JAK/STAT 信号通路中关键因子表达对真性红细胞增多症的诊断价值Table 3 Diagnostic value of the expression of key factors in JAK/STAT signal pathway in peripheral blood for polycythemia vera

2.4 发生与未发生血栓事件患者JAK/STAT 信号通路中关键因子mRNA 表达比较

发生血栓事件患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平均较未发生患者高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 发生与未发生血栓事件患者JAK/STAT 信号通路中关键因子mRNA 表达比较（±s）Table 4 Comparison of mRNA expression of key factors in JAK/STAT signaling pathway between patients with and without thrombotic events（±s）

表4 发生与未发生血栓事件患者JAK/STAT 信号通路中关键因子mRNA 表达比较（±s）Table 4 Comparison of mRNA expression of key factors in JAK/STAT signaling pathway between patients with and without thrombotic events（±s）

血栓事件发生未发生t 值P 值n 30 50 JAK1 6.14±1.31 2.81±0.82 16.652 0.000 STAT3 8.21±1.67 5.11±1.02 10.324 0.000 IL-6 6.58±1.45 3.72±0.94 10.711 0.000 TNF-α 5.47±1.26 2.83±0.74 11.827 0.000

2.5 JAK/STAT 信号通路中关键因子与真性红细胞增多症患者血栓事件的关系

单因素、多因素分析可知，JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 与真性红细胞增多症患者血栓事件有关（P＜0.05）。见表5。

2.6 不同JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平患者累积生存情况

将随访（36 个月）维持的65 例患者分别按照JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达的不同，高JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 组无血栓事件进展生存期明显低于低JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 不同JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达患者累积生存曲线Figure 2 different Jak1，STAT3，IL-6 and TNF-α Cumulative survival curve of patients with mRNA expression

3 讨论

综合以往文献，发现JAK/STAT 信号通路激活在真性红细胞增多症发生的机制多集中于JAK2 突变，JAK2基因V617F 突变作为BCR/ABL 阴性骨髓增殖性疾病中最为典型的突变，致使JAK/STAT 信号通路及部分其他信号通路被激活，造成下游通路过度磷酸化，导致其不依赖于促血小板及促红细胞生成素等外源性细胞因子作用，而持续激活，致使红细胞异常增殖、分化，加剧病情进展［7-9］。本研究中观察组外周血JAK/STAT 信号通路中关键因子JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达均较对照组高，充分证实上述观点，说明外周血JAK/STAT 信号通路持续激活或过度表达为真性红细胞增多症发病机制的重要因素。炎症因子IL-6 可结合JAK受体，致使JAK 大量集聚，偶联STAT3 磷酸化，从而造成下游炎症基因转录。激活后的STAT3 可促使Th17 细胞分化，刺激IL-6、TNF-α 等大量炎症细胞产生。因此，本研究认为调控JAK/STAT 信号通路的相关分子均有可能参与真性红细胞增多症，检测其水平，有助于疾病临床诊断。ROC 曲线表明，JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 诊断真性红细胞增多症的AUC 均在0.7 以上，且各因子联合诊断AUC 最大，具有良好诊断效能，可作为真性红细胞增多症诊断的潜在生物学标志物。此外，白细胞计数＞10×109/L、中性粒细胞百分比＞70%及C 反应蛋白水平＞8 mg/L 患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达高于白细胞计数≤10×109/L、中性粒细胞百分比55%～70%及C 反应蛋白水平≤8 mg/L 患者，分析原因，可能与JAK/STAT 信号通路参与调控炎症反应有关。

血栓事件为真性红细胞增多症最常见并发症，血栓形成过程较为复杂，在高流速状态小，高红细胞比容致使血液黏度增加，血小板离心移至血管壁，黏附于血管壁胶原蛋白及血管性血友病因子，从而引起血栓形成［10］。本研究中发生血栓事件患者JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达均较未发生患者高，提示外周血JAK/STAT 信号通路相关分子过度表达与真性红细胞增多症患者血栓事件发生有关，且单因素、多因素分析结果充分证实了这一观点。究其原因，可能是由于血栓形成与炎症相关。慢性炎症被认为是骨髓增殖性疾病进展的重要驱动力，炎症可引起内皮细胞损伤，进而激活机体促凝血机制、抑制抗凝剂纤溶系统，进而诱发血栓事件，且血栓形成中的物质同样可引起炎症反应［11］。IL-6、TNF-α 为重要的早期炎症因子，其中IL-6 在血栓事件中的机制如下：①致使中性粒细胞大量集聚于炎症部位，延缓中性粒细胞凋亡，造成氧自由基及弹性蛋白酶大量释放，破坏血管内皮细胞及上皮细胞结构，增加血管通透性，引起严重细胞间质水肿；②促进单核细胞及T淋巴细胞释放大量炎症介质，致使炎症反应加剧［12-13］；TNF-α参与血栓事件的机制表现为：①直接作用于血管内皮细胞，增强血管通透性，致使血管内皮细胞凝血系统激活，加速微血栓形成，同时激活单核细胞及血管内皮细胞，增加组织因子表达，使得组织处于高凝状态，为血栓形成创造条件；②激活血小板，调节机体凝血相关因子表达，抑制蛋白C 激活，诱导纤溶酶原激活物抑制剂分泌，抑制机体纤溶系统；③促进趋化因子合成、释放，激活内皮细胞，促进炎症细胞与血管内皮细胞间黏度，同时加剧炎症反应［14-15］。JAK/STAT 信号通路作为大量细胞因子信号转导的重要途径，广泛参与细胞增殖、分化及免疫炎症调节等过程。IL-6可通过活化真性红细胞增多症患者外周血JAK/STAT 信号通路，诱导其STAT3 表达，STAT3 作为一种可于膜上被激活的核转录因子及转录调节蛋白，当其高表达时，结合DNA 的作用元件，致使同生长增殖相关的基因转录激活，造成红细胞、白细胞等大量增殖，加剧机体免疫炎症反应，使得IL-6、TNF-α等炎症因子大量释放［16］。此外，本研究中高JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 组无血栓事件进展生存期明显低于低JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 组，提示JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 对真性红细胞增多症患者无血栓事件进展生存具有预测价值。

综上所述，真性红细胞增多症患者外周血JAK/STAT 信号通路中关键因子JAK1、STAT3、IL-6、TNF-α mRNA 表达上调，且与血栓事件发生及无血栓事件进展生存期有关，具有重要临床意义。