miR-449a与miR-19b-3p在急性脑梗死介入取栓前后的水平变化及检测价值

盛文乾君 贾若飞 钟金浩 邓德贤

急性脑梗死是临床常见神经科疾病，多由脑栓塞、脑血栓形成而致，具有高发病率、高致残率、高死亡率等特点，日益成为威胁居民生命安全的主要疾病之一，防治形势极为严峻［1-2］。目前，静脉溶栓在急性脑梗死治疗中有明显优势，但该疗法存在明显限制性，如凝血功能正常、发病时间窗短等［3］。研究证实，介入取栓术在急性脑梗死患者神经功能和预后改善中能获得显著益处［4］。微小RNA-449a（microRNA-449a，miR-449a）是miR-449家族重要成员，可通过参与血管平滑肌细胞表型转化参与炎症性疾病发生发展［5］。微小RNA-19b-3p（microRNA-19b-3p，miR-19b-3p）与神经功能、炎症损伤密切相关，被认为可作为诊断脑梗死的生物学指标［6］。本研究对此进行探讨，旨在为临床提供数据支持。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取佛山市中医院2019年8月至2021年8月116 例急性脑梗死患者作为观察组，其中男63 例，女53 例，平均年龄（59.13±6.28）岁。另选取同期58 例健康体检者作为对照组，其中男33 例，女25例，平均年龄（58.39±6.05）岁。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会审批通过。

1.2 选取标准

纳入标准：①观察组均经头颅CT 或MRI 检查显示存在脑梗死病灶，符合《中国急性缺血性脑卒中早期血管内介入诊疗指南2018》中急性脑梗死相关诊断标准［7］，且均为首次发病，拟行介入取栓术治疗，参与本研究前未接受脑梗死相关治疗；②对照组体检各项指标均显示正常；两组入试者或家属均知情本研究，自愿签订知情承诺书。排除标准：①伴有脑出血患者；②合并凝血障碍疾病者；③存在脑外伤、颅内肿瘤疾病或血管畸形者；④妊娠期、哺乳期女性；⑤既往存在精神疾病、认知障碍疾病者；⑥心肝肾等其他重要脏器严重功能异常者；⑦存在介入取栓术禁忌者；⑧属于急性脑梗死复发者。

1.3 方法

两组均行介入取栓术治疗，术后均给予抗血小板、血压管理、营养神经等常规处理。

1.3.1 miR-449a、miR-19b-3p 水平检测方法

于对照组入院当日、观察组介入取栓前、介入取栓后12 h 采集清晨空腹静脉血4 mL，采用离心机以3 000 r/min 的速率离心处理10 min，离心半径为10 cm，取上清液，保存于-70℃冰箱内，待检。将细胞裂解液加入血清样本中进行裂解，采用美国Invitrogen 公司的Trizo 试剂盒提取总RNA，之后利用美国Invitrogen 公司的紫外分光光度计测定RNA 浓度，确认合格后采用日本Takara公司的反转录试剂盒合成cDNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应法（qT-PCR）进行扩增，以U6 为内参，由上海生工生物工程有限公司合成引物序列，miR-19b-3p 反应条件为：94℃3 min，94℃45 s，退火55 ～59℃复性30 s，72℃延伸1 min，40 个循环；miR-449a 反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性15s，600C 延伸30s，40 个循环，采用2-ΔΔCt法计算miR-499a、miR-19b-3p 的相对表达量。

1.3.2 预后判定方法

随访30 d，以改良Rankin 量表（Modified Rankin Scale，mRS）［8］作为依据判定预后情况，≤2分判定为预后良好，＞2 分判定为预后不良。

1.4 统计学分析

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计量资料以（±s）描述，采用独立样本t检验；计数资料用n（%）表示，χ2检验；使用交互作用系数γ 分析交互作用及作用类型，其中γ=βeg/βe，βeg表示交互作用的回归系数，βe表示单独因素的回归系数，当γ＜1时呈负向交互作用，当γ＞1 时呈正向交互作用，当γ=1 时无交互作用；当交互作用OR大于两单独因素OR值的乘积时为超相乘模型，小于两单独因素OR 值的乘积时为次相乘模型，等于两单独因素OR值的乘积-1 时为相加模型；预测价值采用受试者工作特征（ROC）曲线分析，联合预测实施Logistic 二元回归拟合，返回预测概率Logit（p），将其作为独立检验变量。P＜0.05 表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-449a、miR-19b-3p 水平比较

观察组血清miR-449a低于对照组，miR-19b-3p高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组血清miR-449a、miR-19b-3p 水平（±s）Table 1 serum levels of mir-449a and mir-19b-3p in the two groups（±s）

表1 两组血清miR-449a、miR-19b-3p 水平（±s）Table 1 serum levels of mir-449a and mir-19b-3p in the two groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 116 116 miR-449a 1.14±0.28 2.06±0.47 16.024＜0.001 miR-19b-3p 11.28±2.61 5.12±1.54 16.575＜0.001

2.2 观察组介入取栓前后血清miR-449a、miR-19b-3p 水平

观察组介入取栓后12 h 血清miR-449a 高于介入取栓前，miR-19b-3p 低于介入取栓前，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 观察组介入取栓前后血清miR-449a、miR-19b-3p水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum mir-449a and mir-19b-3p levels before and after thrombectomy in the observation group（±s）

表2 观察组介入取栓前后血清miR-449a、miR-19b-3p水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum mir-449a and mir-19b-3p levels before and after thrombectomy in the observation group（±s）

组别介入取栓前介入取栓后12 h t 值P 值n 116 116 miR-449a 1.14±0.28 1.38±0.22 7.259＜0.001 miR-19b-3p 11.28±2.61 9.75±2.03 4.984＜0.001

2.3 不同预后患者临床资料及介入取栓前后血清miR-449a、miR-19b-3p 水平

随访30 d，无病例脱落。不同预后患者年龄、性别、吸烟史、术中取栓次数、介入取栓前血清miR-449a、miR-19b-3p 水平差异无统计学意义（P＞0.05）；预后不良患者发病至手术时间（DPT）长于预后良好患者，介入取栓前NIHSS 评分高于预后良好患者，介入取栓后12 h 血清miR-449a 低于预后良好患者，miR-19b-3p 高于预后良好患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同预后患者临床资料及介入取栓前后血清miR-449a、miR-19b-3p 水平比较［n（%），（±s）］Table 3 clinical data of patients with different prognosis and comparison of serum mir-449a and mir-19b-3p levels before and after interventional thrombectomy［n（%），（±s）］

表3 不同预后患者临床资料及介入取栓前后血清miR-449a、miR-19b-3p 水平比较［n（%），（±s）］Table 3 clinical data of patients with different prognosis and comparison of serum mir-449a and mir-19b-3p levels before and after interventional thrombectomy［n（%），（±s）］

资料t/χ2值P 值年龄（岁）性别预后不良患者（n=28）60.03±6.14预后良好患者（n=88）58.84±6.69 0.836 0.119 0.405 0.730男女16（57.14）12（42.86）47（53.41）41（46.59）吸烟史0.251 0.616有无发病至手术时间DPT（h）介入取栓前NIHSS 评分术中取栓次数（次）血清miR-449a介入取栓前介入取栓后12 h血清miR-19b-3p介入取栓前介入取栓后12 h 8（28.57）20（71.43）8.02±1.16 15.20±2.35 2.31±0.58 21（23.86）67（76.14）6.89±0.93 12.37±2.08 2.18±0.49 5.264 6.075 1.169＜0.001＜0.001 0.245 1.10±0.26 1.21±0.18 1.15±0.30 1.43±0.24 0.792 4.462 0.430＜0.001 11.63±2.44 11.39±2.35 11.17±2.16 9.23±2.07 0.951 4.653 0.344＜0.001

2.4 血清miR-449a、miR-19b-3p 表达水平对预后的交互作用分析

根据介入取栓后12 h 血清miR-449a、miR-19b-3p 表达均数为界，分为低表达与高表达。血清miR-449a 单独低表达所致预后不良的OR为7.619，miR-19b-3p 单独高表达所致预后不良的OR为3.800，两者同时存在时，交互作用OR为20.583，γ 为2.265，提示血清miR-449a 低表达与miR-19b-3p 高表达在预后不良中呈正向交互作用（P＜0.05）；20.583＜3.800×7.619，提示血清miR-449a 低表达与miR-19b-3p 高表达为次相乘模型。见表4。

表4 血清miR-449a、miR-19b-3p 对预后的交互作用分析Table 4 interaction analysis of serum mir-449a and mir-19b-3p on prognosis

2.5 血清miR-449a、miR-19b-3p 预测预后价值

ROC 曲线分析，介入取栓后12 h 血清miR-449a 单独预测预后不良的AUC 为0.775（95%CI：0.688～0.847），miR-19b-3p 单独预测预后不良的AUC 为0.751（95%CI：0.662～0.827），两者联合预测预后不良的AUC 为0.892（95%CI：0.821～0.942），明显优于两者单独预测（P＜0.05）。见表5、图1。

表5 血清miR-449a、miR-19b-3p 预测预后价值Table 5 Predictive prognostic value of serum miR-449a and miR-19b-3p

图1 预测预后价值Figure 1 prognostic value

3 讨论

现阶段，介入取栓术是临床治疗急性脑梗死的重要手段，可通过机械取栓、支架取栓等方式解除血栓，再通闭塞血管，临床实践证实，该疗法具有较高取栓成功、血管再通率，但受多种因素干扰，约有40%患者伴有预后不佳风险，对患者生命质量造成严重威胁［9］。因此，积极探索可靠的生物学指标早期预测介入取栓预后，对及时采取针对性、科学性治疗措施、降低预后不良及死亡风险具有重要意义。

近年来，多项相关报道指出，miRNA 与神经系统发育、损伤、修复密切相关，急性脑梗死患者miRNA 表达谱改变明显［10-11］。miR-449a 与miR-449b、miR-449c 共用一个启动子，位于Cdc20b基因的第二个内含子上，具有高度保守性，是心脑血管疾病的研究热点。miR-19b-3p 是一种能稳定存在于血清中的具有调控基因表达的非编码小分子。本研究结果显示，观察组血清miR-449a 低于对照组，miR-19b-3p 高于对照组，与苏立华等［12］、高华等［13］研究结果一致。说明miR-449a、miR-19b-3p 均参与急性脑梗死发生过程。一项动物实验证实，miR-449a 参与急性脑梗死的作用机制是其能通过低表达或缺失表达促进脑细胞增殖、凋亡，加快局部脑组织炎症反应发生，从而不断损害脑组织［14］。miR-19b-3p 则是由于局部脑组织缺氧或缺血促使缺氧诱导因子1α 表达显著增加后导致其表达水平靶向上调，随着缺血缺氧损伤加重其表达水平上调越显著，在急性脑梗死发生中发挥促进作用［15］。本研究还显示，观察组介入取栓后12 h 血清miR-449a 高于介入取栓前，预后不良患者低于预后良好患者miR-19b-3p 低于介入取栓前，预后不良患者高于预后良好患者，可见miR-449a、miR-19b-3p 水平在介入取栓后出现明显改善，且对预后情况有重要影响。分析原因，考虑为介入取栓后血栓被成功取出，闭塞血管恢复通畅，脑组织血流血供增加，脑组织炎症反应、缺血缺氧损伤得到有效减轻，神经功能缺损逐渐恢复，miR-449a、miR-19b-3p 含量随着病情改善呈现相应改变，且与病情改善程度之间联系紧密，故会对预后产生影响。此外，本研究数据表明，血清miR-449a 单独低表达所致预后不良的OR为7.619，miR-19b-3p 单独高表达所致预后不良的OR为3.800，两者同时存在时呈正向交互作用OR为20.583，说明miR-449a 低表达会增强miR-19b-3p 高表达在急性脑梗死发生发展及预后改善过程中的作用效应，提示临床可通过检测两者在急性脑梗死介入取栓前后的水平变化评估病情与预后改善情况。

此外，本研究创新性尝试分析血清miR-449a、miR-19b-3p 对急性脑梗死介入取栓预后的预测价值，结果发现，两者联合预测预后不良的AUC 高达0.892，明显优于两者单独预测。

综上可知，急性脑梗死患者miR-449a 呈低表达，miR-19b-3p 呈高表达，两者同时存在时具有正向交互作用，介入取栓后早期检测两者水平可作为预测预后不良的重要辅助途径。