MLCK、E-cadherin、β-catenin水平预测高脂血症急性胰腺炎严重程度及预后

刘丽娜 郭瑞芳 梁永纲 东丽

急性胰腺炎是临床上常见的急腹症之一，其有着起病急、病情发展快、病情凶险且死亡率高等特点，患者常表现出急性腹痛、发热、恶心呕吐等症状［1］。高脂血症性急性胰腺炎（hyperlipidemic acute pancreatitis，HAP）指因血脂水平过高而使过量三酰甘油（Triglyceride，TG）被水解成大量游离脂肪酸，使胰腺血供出现障碍，从而出现胰腺坏死的急性炎症，与其他病因引起的急性胰腺炎相比，HAP 病情更凶险且并发症更多［2］。肌球蛋白轻链激酶（Myosin light-chain kinase，MLCK）是存在于各种肌细胞与非肌细胞中的蛋白激酶，在多种疾病的发生与发展中起到重要作用［3］。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是钙依赖的细胞黏着糖蛋白，可促进相邻细胞形成稳定的连接并维持组织结构完整［4］。β-连环蛋白（β-catenin）是一种多功能蛋白，可协助细胞对细胞外的信号做出反应［5］。近来有研究发现这三种因子在HAP 患者病情发展进程中起到重要作用［6］。基于此，本研究通过对HAP 患者早期MLCK、E-cadherin 及β-catenin 相对mRNA表达进行检测，旨在探究其与患者病情严重程度及预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取内蒙古自治区人民医院2018年6月至2020年6月收治的75 例高脂血症性急性胰腺炎患者为HAP 组，男48 例，女27 例；平均年龄（54.43±9.86）岁。参考亚特兰大分类［7］将患者分为轻症组（n=53）：无器官衰竭与局部并发症；重症组（n=22）：出现器官衰竭或局部并发症。纳入标准：①HAP 组患者符合《中国急性胰腺炎诊治指南（2013年，上海）》［8］中HAP 相关诊断；②发病时间＜12 h；③入院前未经过任何治疗的患者；④病情初次发作的患者；⑤未合并其他胰腺疾病的患者。排除标准：①合并恶性肿瘤的患者；②合并严重精神疾病的患者；③处于哺乳期或妊娠期的患者；④胆源性及酒精性急性胰腺炎。选择60 例同期来院体检者为正常组，男36例，女24 例；平均年龄（55.82±10.14）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经院医学伦理委员会批准通过，受试者或家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 MLCK、E-cadherin 及β-catenin 检测

HAP 组于入院后第二天清晨、正常组于体检当天抽取空腹静脉血各5 mL，分离单个细胞核后提取总RNA，将RNA 反转录为cDNA。设计引物序列，MLCK 上游：5′-CGCCACTTCCAGATAGAC TAC-3′，下游：5′-ACCTTCCTCCATCGTTTCC-3′，E-cadherin 上游：5′-AGGCTAGAGGGTCACCGCGTC-3′，下游：5′-GCTTTGCAGTTCCGACGCCAC-3′，β-catenin 上游：5′-AAGACATCACTGAGCCT CCAT-3′，下游：5′-CGATTTGCGGGACAAAGGG CAA-3′。取10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）、5 μL 去RNA 酶的水、3 μL cDNA、1.6 μL 引物、0.4 μL ROX Reference DyaⅡ（50×）共计20 μL 混合置于荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）仪（北京乐普医疗科技有限责任公司）内，反应条件为95℃30 s，95℃5 s，60 ℃34 s。进行40 个循环，反应结束后以GAPDH 作为内参照物，采用2-ΔΔCt法［9］检测各组外周单个核细胞内MLCK、E-cadherin 及β-catenin 的相对mRNA 表达。

1.2.2 血清指标检测

采用免疫比浊法检测血清C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平，采用EPS 底物法检测血清淀粉酶（amylase，AMY）水平，采用甘油激酶法检测血清甘油三酯（Triglyceride，TG）水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计软件处理数据，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Perason 相关系数法，采用受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析胰腺组织早期MLCK、E-cadherin 及β-catenin 表达预测HAP 患者预后的效能，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达量及血液指标比较

三组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达量及CRP、AMY、TG 水平：重度组＞轻症组＞正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 三组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达比较（±s）Table 1 Comparison of relative mRNA expressions of MLCK，E-cadherin and β-catenin in peripheral blood among the three groups（±s）

表1 三组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达比较（±s）Table 1 Comparison of relative mRNA expressions of MLCK，E-cadherin and β-catenin in peripheral blood among the three groups（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与轻症组比较，bP＜0.05。

组别正常组轻症组重症组F 值P 值n 60 53 22 MLCK 1.00±0.11 2.14±0.32a 2.36±0.30ab 408.849＜0.001 E-cadherin 1.00±0.09 1.87±0.29a 2.03±0.22ab 319.720＜0.001 β-catenin 1.00±0.08 1.68±0.28a 1.81±0.22ab 210.557＜0.001 CRP（mg/L）6.73±1.73 101.26±10.54a 114.52±11.02ab 2527.230＜0.001 AMY（U/L）83.14±10.18 688.85±62.34a 732.17±66.57ab 2799.188＜0.001 TG（mmol/L）1.02±0.33 15.54±4.28a 19.51±5.13ab 368.727＜0.001

2.2 良好组与不良组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达及血液指标比较

良好组外周血MLCK、E-cadherin 及β-catenin相对mRNA 表达量均显著低于不良组，CRP、AMY及TG 水平均显著低于不良组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 良好组与不良组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达及血液指标比较（±s）Table 2 Comparison of relative mRNA expressions of peripheral blood MLCK，E-cadherin and β-catenin and blood indicators between good group and poor group（±s）

表2 良好组与不良组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达及血液指标比较（±s）Table 2 Comparison of relative mRNA expressions of peripheral blood MLCK，E-cadherin and β-catenin and blood indicators between good group and poor group（±s）

组别良好组不良组t 值P 值n 60 15 MLCK 2.15±0.25 2.42±0.22 3.825＜0.001 E-cadherin 1.87±0.24 2.10±0.19 3.445 0.001 β-catenin 1.66±0.23 1.94±0.18 4.383＜0.001 CRP（mg/L）101.52±8.86 119.68±9.03 7.074＜0.001 AMY（U/L）688.14±58.45 755.21±60.68 3.946＜0.001 TG（mmol/L）14.66±3.39 24.88±3.15 10.583＜0.001

2.3 外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 与血液指标的关系

MLCK 与CRP、AMY 及TG 呈正相关（r=0.538、0.459、0.564，P＜0.05）；E-cadherin 与CRP、AMY 及TG 呈正相关（r=0.524、0.442、0.544，P＜0.05）；β-catenin 与CRP、AMY 及TG 呈正相关（r=0.496、0.425、0.517，P＜0.05）。

2.4 外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 预测预后的价值

ROC 曲线结果显示：MLCK 敏感性93.33%，特异性86.67%；E-cadherin 敏感性86.67%，特异性86.67%；β-catenin 敏感性80.00%，特异性93.33%。见表3、图1。

表3 外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 与HAP 患者预后预测效能Table 3 Efficiency of peripheral blood MLCK，E-cadherin and β-catenin in predicting prognosis in patients with HAP

图1 ROC 曲线分析Figure 1 ROC curve analysis

3 讨论

HAP 患者以中青年居多，主要由酗酒、肥胖、糖尿病史引起［10］。研究显示，HAP 患者特征明显，可与胆源性、酒精性急性胰腺炎区别开，因其严重程度与TG 水平相关，因此控制TG 水平对HAP 患者的治疗与预后起到重要作用［11］。

本研究发现HAP 患者的外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达量及CRP、AMY、TG 水平以重症组最高，轻症组次之，正常组最低，说明HAP 患者的炎症与血脂水平较正常人更高，且随着病情严重程度的增加，各项指标呈上升趋势。韦宇乐等［12］对小鼠模型的MLCK、E-cadherin、β-catenin 表达进行探究，得出三项指标在HAP 早期表达上调的结论，与本研究结果相一致，进一步证明HAP 患者与正常人的指标存在差异。本研究还将病情严重程度不同的患者进行对比，得出病情越严重，MLCK、E-cadherin、β-catenin 表达越高的结论。Shi 等［13］研究发现，病理状态下细胞因子等多种神经体液介质参与屏障功能损伤的发展进程，钙离子与钙调素结合，使MLCK 磷酸化，从而使肌蛋白微丝向外滑行，肌动蛋白与肌球蛋白细胞骨架收缩，细胞间通透性增加，组织屏障功能受到破坏。E-cadherin 在多种上皮细胞中广泛表达，通过钙离子介导上皮细胞的黏附作用，在上皮细胞紧密连接的建立和极性形态的维持中起重要作用，当其异常表达时导致细胞分化，细胞间连接疏松脱落，进而诱导炎症细胞因子等形成，促进炎性趋化因子的转移［14］。赵凯等［15］发现，死亡患者的CRP 等炎症指标显著高于生存患者，且联合检测的敏感度与特异度较高，与本研究结果相似。本研究更发现良好组外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin 相对mRNA 表达量均显著低于不良组，这与许多炎症因子可激活β-catenin，从而使E-cadherin/catenin复合体连接失效，细胞失去黏附功能，细胞之间的连接断开并脱落，细胞的迁移力与侵袭性增强有关；同时，细胞间紧密连接功能中断，导致肌动蛋白重新排列，从而使MLCK 表达降低。

本研究还发现MLCK、E-cadherin、β-catenin 均与CRP、AMY、TG 呈正相关，说明MLCK、E-cadherin、β-catenin 与炎症因子、血脂因子密切相关，通过ROC 曲线发现MLCK、E-cadherin 及β-catenin预测HAP 患者预后的敏感性与特异性较高。这与张征等［16］的研究相一致，表明MLCK、E-cadherin及β-catenin 可调控HAP 的严重程度，对预测HAP患者预后有较高的诊断价值。

综上所述，外周血MLCK、E-cadherin、β-catenin表达可作为判断HAP 患者病情严重程度的标准，还可作为预测HAP 患者预后的指标，术前检测HAP 患者的MLCK、E-cadherin、β-catenin 表达可评估患者预后，为制定后续治疗方案提供有用的参考价值。