单基因METTL14在泛癌中的综合分析

赵丽 闫清 赵晓雯 彭瑞 朱明雪 王晔 牟晓峰★

肿瘤的形成是一个十分复杂的过程，伴随着癌细胞的增殖、抗凋亡、血管生成增强、免疫逃逸等［1］。其中，肿瘤微环境（tumor microenvironment ，TME）对肿瘤的发展起着至关重要的作用［2］。TME 由细胞成分和细胞外基质组成，细胞成分中浸润的免疫细胞占很大比重［3］。肿瘤浸润的免疫细胞和基质细胞与血管生成，免疫抑制，化疗抵抗和肿瘤细胞迁移有关［4］。了解肿瘤的微环境，包括免疫细胞的浸润，可能有助于进一步探索肿瘤发展的机制。越来越多的证据表明，基质细胞和免疫细胞在肿瘤组织微环境中的重要性，与肿瘤微环境相关的一系列基因也具有作为癌症的新型生物标志物的潜力［5］。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰是哺乳动物细胞中最丰富的RNA 修饰，越来越多的研究都显示m6A在人类肿瘤发生过程中的起着关键的作用［6］。甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like protein14，METTL14）是一种主要的RNA N6-腺苷甲基转移酶，通过调节RNA 功能参与肿瘤的进展，现已发现METTL14与不同类型癌症中的肿瘤发生有关［7］。本研究中，通过收集TCGA 数据库中的33 种人类癌症的表达数据，寻找METTL14在各个肿瘤中的表达，以及其与预后、免疫指标之间的关联，为确认METTL14参与肿瘤免疫调控提供新的思路。

1 方法

1.1 数据采集和METTL14 在泛癌中的表达分析

从TCGA 数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和基因型-组织表达项目（Genotype-Tissue Expression，GTEx）数据库（https：//gtexportal.org/）中获取各个肿瘤及正常组织中的基因数据，从肿瘤细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）数据库（https：//portals.broadinstitute.org/）中下载各个肿瘤细胞系的数据，以了解基因在各个肿瘤样本中癌与癌旁的差异。其中从GTEx 数据集分析中观察到基因在31 个组织的表达水平，整合GTEx 数据库中的正常组织的数据和TCGA 肿瘤组织的数据，分析27 种肿瘤的表达差异。使用Kruskal-Wallis 检验分析METTL14在不同正常组织和不同肿瘤组织中的表达水平。

1.2 METTL14 在泛癌中的预后分析

使用单因素Cox 回归分析计算METTL14在33 种肿瘤中的表达和患者生存的相关性，Kaplan-Meier 生存分析用来比较METTL14的表达水平高低与肿瘤预后之间的关系。

1.3 METTL14 与免疫微环境的相关性分析

本次研究从肿瘤免疫数据库（Tumor IMmune Estimation Resource，TIMER）下载33 种癌症的六种免疫浸润细胞的评分数据，分别分析METTL14表达与免疫细胞评分的相关性。使用R 软件包estimate 分析各个肿瘤样本的免疫评分和基质评分，观察在33 个肿瘤中METTL14表达与免疫评分的相关性。当P＜0.05 和R＞0.20 时，认为相关性是显著的而且是正相关的。

1.4 METTL14 表达与MMRs 及DNMTs 的表达关系分析

MMRs 是细胞内的错配修复机制，该机制关键基因的功能丧失会导致DNA 复制错误无法被修复，进而导致较高水平的体细胞突变的产生［8］。DNA 甲基化是DNA 化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA 序列的前提下，改变遗传表型。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性及DNA 与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达［9］。研究利用TCGA 的表达谱数据评估5 个MMRs 基因：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM突变与基因表达的关系。还分析了METTL14表达与四个甲基转移酶（DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B）表达的相关性。当P＜0.05 和R＞0.20 时，认为相关性是显著的而且是正相关。

1.5 统计学方法

使用Kruskal-Wallis 检验分析METTL14在不同正常组织和不同肿瘤组织中的表达水平；单因素Cox 回归分析计算METTL14在肿瘤中的表达和患者生存的相关性；Kaplan-Meier 生存分析用来比较METTL14的表达水平高低与肿瘤预后之间的关系；当P＜0.05 和R＞0.20 时，相关性被认为是显着的和正的。所有统计分析均使用R 软件包（v4.0.3）进行，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 METTL14 在不同肿瘤中的表达

小提琴图显示METTL14在GTEx（图1A）、CCLE（图1B）以及TCGA（图1C）中的表达。整合GTEx 与TCGA 数据库结果显示，METTL14在大多数实体肿瘤中表达水平较正常组织低（图1D）。

图1 METTL14 在组织中的表达水平Figure 1 The expression level of METTL14 in tissues

2.2 METTL14 在不同肿瘤中的预后分析

METTL14与肿瘤预后的关系分析结果显示，METTL14仅在KICH（HR=1.21，P=0.021 0）、KIRC（HR=0.90，P＜0.000 1）、LGG（HR=1.07，P=0.014 0）、MESO（HR=0.91，P=0.049 0）、READ（HR=0.80，P=0.009 4）中存在预后意义（图2F）。K-M 生存曲线结果显示KICH、LGG 中METTL14的高表达，以及KIRC、MESO、READ 中METTL14的低表达可能与患者的不良预后有关（图2A-E）。

图2 METTL14 表达与癌症患者的总体生存率的关系Figure 2 Relationship between METTL14 expression and overall survival of cancer patients

2.3 不同肿瘤中METTL14 与肿瘤免疫浸润和肿瘤微环境之间的相关性

METTL14表达与33 种癌症的六种免疫浸润细胞数据的相关性结果显示，METTL14的表达水平与BLCA、COAD、HNSC 中的免疫浸润水平最显著相关。且METTL14的表达水平均与BLCA、COAD、HNSC 中的六种肿瘤浸润性淋巴细胞即B细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的水平呈正相关（P＜0.001，图3A）。33 个肿瘤中，METTL14表达与免疫评分、基质评分以及ESTIMATE 的免疫评分关系结果显示，METTL14的表达与SARC 的免疫评分呈负相关，与PAAD、STAD 的免疫评分呈正相关。METTL14的表达与BRCA 的基质评分呈正相关，与SARC、THCA 的基质评分呈负相关。METTL14的表达与SARC、THCA、GBM ESTIMATE 的免疫评分均呈负相关（图3B、表1）。

图3 METTL14 表达与不同类型癌症中的免疫浸润水平的关系Figure 3 Relationship between METTL14 expression and the level of immunoinvasion in different types of cancer

表1 METTL14 表达与免疫评分、基质评分以及ESTIMATE 的免疫评分关系Table 1 The relationship between METTL14 expression and immune score，matrix score and immune score of ESTIMATE

2.4 不同肿瘤中METTL14 与免疫检查点之间的相关性

METTL14与免疫检查点基因的表达关系结果显示，各个肿瘤中METTL14的表达水平与这40 多个检查点存在相关性，且大部分呈正相关。见图4。

图4 METTL14 在泛癌中的表达与免疫检查点基因表达的关系Figure 4 Relationship between expression of METTL14 and immune checkpoint gene expression in pan-carcinoma

2.5 不同肿瘤中METTL14 的表达水平与MMRs及DNMTs 的关系

METTL14的表达水平与5 个MMRs 基因的关系结果显示，几乎所有的MMRs 基因都与METTL14的表达水平呈正相关（P＜0.05）。

METTL14表达水平与四个DNMTs 表达关系结果显示，METTL14的表达水平与DNMTs 的表达水平在几乎所有肿瘤中均呈显著正相关（P＜0.05，r＞0.20）。见图5。

图5 METTL14在泛癌中的表达与MMRs及DNMTs的关系Figure 5 Relationship between the expression of METTL14 and MMRs and DNMTs in pan-carcinomas

3 讨论

RNA 修饰是如今肿瘤治疗和表观遗传学研究的热门话题，m6A 修饰在mRNA 加工过程中涉及许多步骤，以调节基因表达［10］。m6A 修饰过程受甲基转移酶，脱甲基酶和相关结合蛋白的调控［11］，而METTL14是介导m6A 修饰的几种甲基转移酶之一。已有研究报道过，与正常组织相比，METTL14在KIRC［12］、COAD［13］等多数肿瘤中的表达都是下调的。本次研究中整合了TCGA 与GTEx 数据库的样本，观察到整合后的数据库中METTL14在多种癌症中表达降低。而后根据METTL14表达水平的高低，分为高低表达组，进一步分析了METTL14在泛癌中的预后情况。结果显示KICH、LGG 中METTL14的高表达，以及KIRC、MESO、READ 中METTL14的低表达可能与患者的不良预后有关。提示METTL14有望成为上述肿瘤中预后观察指标，但需进一步研究验证。

TME 内的免疫细胞在肿瘤发生中起重要作用［14］。有研究表示肿瘤微环境中免疫细胞的募集，可能是影响免疫治疗后临床结果改善的重要因素［15］。所以本次研究探究了METTL14表达与不同类型癌症中的免疫浸润水平和免疫评分的关系。结果也显示了METTL14参与了肿瘤的免疫浸润，且它的表达水平也与免疫评分具有相关性。此外，研究还观察了METTL14的表达与常见的40 多个检查点的关系。结果显示，各个肿瘤中METTL14的表达水平与这40 多个检查点存在相关性，且大部分呈正相关。也有研究表示m 6 A 修饰的抑制通过改变肿瘤微环境和CD8+T 细胞的募集使肿瘤对免疫疗法敏感。揭示了RNA 甲基化在适应性免疫中的功能，并提供了METTL14作为抗癌免疫治疗的潜在治疗靶点［16］。这均可以表示METTL14可能参与了集体免疫的过程，并提示METTL14可能是潜在的生物标志物，且在肿瘤免疫中发挥重要作用。

虽然本次研究通过生信分析确定了METTL14在泛癌中的潜在价值，但仍存在不足之处。本次研究只是基于数据库的分析得出的结果，没有经过临床样本测试进行验证，未来的研究可以朝此方向努力。

综上所述，在大多数肿瘤中，METTL14的表达与肿瘤患者的预后和免疫浸润水平相关。本次发现突出了METTL14在肿瘤发生和发展过程中的重要价值，为METTL14在未来肿瘤中的研究和肿瘤的免疫治疗提供新的方向和见解。