STEMI患者外周血p-p38MAPK、p-JNK表达与细胞凋亡及近期预后的关系

2022-06-21王发波叶绵赋李莉许志魏

分子诊断与治疗杂志 2022年5期

王发波叶绵赋李莉许志魏

ST 段抬高型心肌梗死（ST segment elevation myocardial infarction，STEMI）是最严重的急性冠脉综合征类型，病情进展迅速、救治难度大。急诊静脉溶栓能够及时且有效再通冠脉，治疗STEMI 的效果确切，但仍有部分患者会静脉溶栓后发生不良心血管事件，影响近期预后、增加再入院率及死亡率［1-2］。因此，研究影响STEMI 患者静脉溶栓近期预后的相关因素及分子机制是心血管研究领域的热点。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一族调控细胞增殖、凋亡、炎症及氧化应激的信号通路，多项基础研究证实MAPK 家族中p38MAPK、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）过度的磷酸化活化与心肌缺血再灌注损伤过程中的细胞凋亡有关［3-4］。本研究将以接受静脉溶栓治疗成功的STEMI 患者为对象，分析外周血p-p38MAPK、p-JNK 表达与细胞凋亡及近期预后的关系。

1 对象与方法

1.1 一般资料

选择2019年5月至2021年6月期间本院收治的84 例STEMI 患者作为研究的STEMI 组，纳入标准：①符合指南中STEMI 的诊断标准［5］；②成功接受静脉溶栓治疗；③按要求在静脉溶栓前留取外周血单个核细胞（PBMCs）及血清标本；④临床资料及近期预后资料完整；⑤所有入试者及家属均签署知情同意。排除标准：①既往有心肌梗死、脑卒中病史或有其他介入手术史；②合并急慢性感染、肝肾等重要脏器功能障碍、免疫系统疾病、恶性肿瘤。另取同期体检的68 例健康志愿者作为对照组。STEMI 组中男性52 例、女性32 例，年龄平均（63.57±10.85）岁，体质量指数（24.61±6.21）kg/m2；对照组中男性39 例、女性29 例，年龄平均（61.39±11.34）岁，体质量指数（23.85±5.96）kg/m2。两组间一般资料的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs 的分离及p-p38MAPK、p-JNK 表达的检测

静脉溶栓前留取STEMI 组患者的抗凝静脉血约3 mL，体检时留取对照组志愿者的抗凝静脉血约3 mL，采用Ficoll 密度梯度离心法分离PBMCs，加入细胞裂解液提取PBMCs 的蛋白；得到蛋白样本后，加入聚丙烯酰胺凝胶中进行western blot 检测，依次进行电泳分离不同分子量的蛋白、电转硝酸纤维素膜、脱脂牛奶室温封闭、特异性一抗［p-p38MAPK（美国CST 公司）、p-JNK（美国CST公司）、p38MAPK（美国CST 公司）、JNK（美国CST公司）、β-actin（美国Abcam 公司）］4℃孵育、二抗室温孵育，最后在凝胶成像系统中曝光得到p-p38MAPK、p-JNK、p38MAPK、JNK、β-actin 的电泳图，计算蛋白条带的灰度值，计算p-p38MAPK/p38MAPK、p-JNK/JNK 灰度值的比值。

1.2.2 血清中Caspase-3、Caspase-12、sTWEAK 含量的检测

静脉溶栓前留取STEMI 组患者的促凝静脉血约3 mL，体检时留取对照组志愿者的促凝静脉血约3 mL，转速3 000 转/分、半径5.5 cm 离心分离血清后采用酶联免疫吸附法试剂盒（上海酶联生物公司生产）检测Caspase-3、Caspase-12、sTWEAK 的含量。

1.3 STEMI 病情严重程度的评估

根据冠脉CT 情况评估STEMI 病情严重程度，参照Gensini 标准［5］进行评分，分为单支病变患者和多支病变患者，Gensini 积分0～40 分与＞40 分患者。

1.4 STEMI 近期预后的评估

随访静脉溶栓成功后6个月发生主要不良心血管事件（Major adverse cardiovascular events，MACE）［5］的情况，定义为再次血运重建、再发心绞痛、非致命性心肌梗死、心源性死亡、非致死性卒中，发生MACE判断为近期预后不良、其余为近期预后良好。

1.5 统计学处理方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计学处理。计量资料以（±s）表示，组间比较用t检验，通过Pearson 检验分析p-p38MAPK、p-JNK 的表达水平与Caspase-3、Caspase-12、sTWEAK 含量的相关性，通过ROC 曲线分析p-p38MAPK、p-JNK 对近期预后的预测价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STEMI 组与对照组PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平的比较

STEMI 组患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK的表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 STEMI 组与对照组PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 的电泳图Figure 1 Electrophoresis of P-P38MAPK and p-JNK in PBMCs of STEMI group and control group

表1 STEMI 组与对照组PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK表达水平的比较（±s）Table 1 Comparison of expression levels of p-p38MAPK and p-JNK in PBMCs between STEMI group and control group（±s）

组别STEMI 组对照组t 值P 值n 84 68 p-p38MAPK 0.85±0.29 0.46±0.08 10.757＜0.001 p-JNK 0.73±0.21 0.36±0.07 13.909＜0.001

2.2 STEMI 组中不同病情患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平的比较

STEMI 组中多支病变患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK的表达水平明显高于单支病变患者，Gensini 积分＞40 分患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 的表达水平明显高于Gensini 积分0～40 分患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 STEMI 组中不同病情患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平的比较（±s）Table 2 Comparison of expression levels of p-p38MAPK and p-JNK in PBMCs of patients with different conditions in STEMI group（±s）

病情病变数目n 分类单支病变多支病变t 值P 值0～40 分＞40 分t 值P 值48 36 Gensini 积分43 41 p-p38MAPK 0.76±0.28 0.97±0.32 3.200 0.002 0.75±0.25 0.95±0.33 3.140 0.002 p-JNK 0.69±0.21 0.79±0.24 2.032 0.045 0.65±0.24 0.81±0.26 2.933 0.004

2.3 STEMI 组与对照组血清凋亡指标的比较

STEMI 组患者血清Caspase-3、Caspase-12、sTWEAK 含量均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 STEMI 组与对照组血清凋亡指标的比较（±s）Table 3 Comparison of serum apoptosis indexes between STEMI group and control group（±s）

组别STEMI 组对照组t 值P 值n 84 68 Caspase-3（pg/mL）36.51±9.42 14.68±3.58 18.073 0.000 Caspase-12（pg/mL）28.75±7.24 19.02±3.41 10.200＜0.001 sTWEAK（pg/mL）46.28±9.15 30.17±6.62 12.165＜0.001

2.4 STEMI 组p-p38MAPK、p-JNK 表达水平与凋亡指标的相关性

STEMI 组患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK的表达水平与血清Caspase-3（r=0.512、0.418）、Caspase-12（r=0.337、0.575）、sTWEAK（r=0.451、0.393）含量呈正相关（P＜0.05）。

2.5 STEMI 组中不同近期预后患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平的比较

STEMI 组中近期预后不良患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 的表达水平明显高于近期预后良好患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 STEMI 组中不同近期预后患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平的比较（±s）Table 4 Comparison of expression levels ofp-p38MAPK and p-JNK in PBMCs of patients with different short-term prognosis in STEMI group（±s）

近期预后情况预后良好预后不良t 值P 值n 65 19 p-p38MAPK 0.77±0.24 1.12±0.29 5.177＜0.001 p-JNK 0.68±0.18 0.88±0.21 4.101＜0.001

2.6 PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平预测STEMI 组患者近期预后的分析

PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平预测STEMI 组患者近期预后的ROC 曲线见图2，AUC 分别为0.815（95%CI：0.691～0.939，P＜0.05）和0.780（95%CI：0.655～0.906，P＜0.05）。

图2 PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平预测STEMI组患者近期预后的ROC 曲线Figure 2 ROC curve of p-p38MAPK and p-JNK expression levels in PBMCs in predicting the short-term prognosis of patients in STEMI group

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是STEMI 患者接受静脉溶栓治疗后必经的病理生理过程，缺血再灌注通过激活细胞凋亡、炎症反应、氧化应激等生物学环节加重心肌损害，对静脉溶栓的预后造成不利影响，增加不良结局的发生风险［6-7］。

在心肌经历缺血再灌注的过程中，细胞内发生了复杂的信号转导。多项动物实验证实缺血再灌注的心肌中p38MAPK、JNK的磷酸化程度显著增加，抑制p38MAPK、JNK的磷酸化起到心肌保护作用，对心肌组织的细胞凋亡、炎症反应、氧化应激反应均具有抑制作用［8-9］。为了认识MAPK 家族在STEMI 发病中的作用，本研究首先检测了STEMI 患者外周血中p38MAPK、JNK 的磷酸化水平，与健康志愿者比较，STEMI患者PBMCs中p-p38MAPK、p-JNK的表达水平明显增加，表明p38MAPK、JNK 的过度磷酸化与STEMI的发病有关，与相关动物实验的结果吻合。

缺血缺氧、缺血再灌注是刺激p38MAPK、JNK发生磷酸化的重要病理因素，在STEMI 发病过程中p38MAPK、JNK 的过度磷酸化可能反映了心肌缺血缺氧、缺血再灌注的程度较重。本研究通过分析不同病情严重程度STEMI 患者外周血中p38MAPK、JNK 磷酸化水平的差异可知：多支病变、Gensini 积分＞40 分的STEMI 患者PBMCs 中p-p38MAPK、p-JNK 的表达水平更高，表明随着STEMI 病情加重及心肌缺血程度加重，患者外周血中p38MAPK、JNK 发生了过度磷酸化。相关的基础研究均认为p38MAPK、JNK 发生磷酸化后能够进入细胞核，调控Bax、Bcl-2 等凋亡调控基因的表达，进而启动下游级联放大的凋亡反应、引起Caspase-3 及Caspase-12 等发生活化，最终介导细胞凋亡［10-11］。Caspase-3、Caspase-12、sTWEAK 是三种血清中反映STEMI 患者心肌凋亡水平的标志物，既往多项研究［12-13］及本研究均证实STEMI 患者血清中Caspase-3、Caspase-12、sTWEAK 的含量明显升高。进一步通过相关性分析证实STEMI 患者的p-p38MAPK、p-JNK 表达水平与血清Caspase-3、Caspase-12、sTWEAK 含量均呈正相关，提示在STEMI 发病过程中p38MAPK、JNK 的过度磷酸化可能参与心肌细胞的异常凋亡。

尽管静脉溶栓治疗STEMI 的疗效确切，但受到心肌再灌注损伤、心肌细胞凋亡等因素的影响，仍有部分患者在静脉溶栓成功后会发生不良心血管事件。有临床研究证实，血清凋亡分子对STEMI患者的预后及静脉溶栓成功后MACE 的发生具有预测价值［14-15］。本研究已经在STEMI 患者中证实p38MAPK、JNK 的过度磷酸化与凋亡分子的增多相关，在此基础上还进一步分析了p38MAPK、JNK 磷酸化水平与预后的关系。经过静脉溶栓成功后6个月的短期随访，84 例患者中共19 例发生MACE，判断为短期预后不良，与短期预后良好的STEMI患者比较，预后不良患者的PBMCs中p-p38MAPK、p-JNK 表达水平明显增加；经ROC曲线分析，p-p38MAPK、p-JNK 表达水平对短期预后不良、MACE 的发生具有预测价值。

综上所述，STEMI 患者外周血p38MAPK、JNK的过度磷酸化与病情加重、细胞凋亡激活、近期预后不良有关。