针刀对膝骨关节炎兔股直肌组织硬度和纤维化的影响

宫玉榕 林巧璇 刘 晶 郭泽兴 卢莉铭 修忠标

1.福建中医药大学附属人民医院超声医学科，福建福州 350004；2.福建中医药大学附属第三人民医院骨伤科，福建福州 350122；3.福建中医药大学附属人民医院骨伤一科，福建福州 350004；4.福建中医药大学中医学院，福建福州 350122

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是导致中老年患者膝痛和下肢功能障碍的常见病。膝关节动态力平衡失调可造成骨骼肌慢性损伤，引起力学性能下降，继而加重筋骨失衡，导致持续软骨面异常机械应力，加剧软骨退变，这是KOA 发病重要机制之一[1]。骨骼肌慢性损伤修复过程会形成纤维化，严重影响骨骼肌功能[2]。本团队前期研究显示针刀松解股四头肌常见经筋病灶点可调整下肢力线，延缓软骨退变[3]；并通过实时组织弹性成像发现KOA 兔股直肌弹性应变率比值增高[4]。那么，针刀治疗KOA 的作用机制是否与调节股直肌组织硬度和改善其纤维化相关，目前鲜有相关报道。因此，本研究探讨从股直肌组织硬度和纤维化角度探讨针刀治疗KOA 的作用机制，为针刀治疗KOA 的力学效应提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

选取24 只6 月龄普通级健康雄性新西兰兔，体重为（2.2±0.3）kg。实验动物的购买和饲养均由许可证号为SYXK（闽）2019-0007 的福建中医药大学实验动物中心完成。参照随机数字表法，将实验兔分为3 组，分别是空白组、模型组、针刀组，每组各8 只。本研究经福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号：FJTCMIACUC），整个实验过程均符合有关动物的使用及伦理学规定[5]。

1.2 主要试剂与仪器

Masson 染色试剂盒、4%多聚甲醛（G1340、P1110，北京索莱宝）；戊巴比妥钠（P1110，德国Sigma）；戊二醛（F-A17876，美 国AlaAesar）；10%EDTA（GL1794，北京百奥莱博）；一次性使用无菌针刀（202007006，江西老宗医）；全数字化彩色超声波诊断仪（日本日立HI VISION Avius L）；光学显微镜（Motic BA210，深圳博视达光学）；自动脱水机（KL-T1，湖北康龙电子）；组织包埋机（BMJ-A，常州中威电子）；石蜡切片机（RM2235，德国Leica）；高分子石膏（AX002，陕西安信）。

1.3 模型制备

采用本团队前期研究的改良Videman 法[6]制备兔左膝KOA 模型。固定6 周后，模型评价方法采用Lequesne 膝关节评估法[7]，具体包括疼痛、步态、活动度、肿胀情况4 个方面，当Lequesne MG 评分≥4 分，判定为兔左膝KOA 模型制备成功。

1.4 干预措施

空白组和模型组采取同样的抓取和固定，但不予针刀治疗。针刀组治疗点为左后肢的“鹤顶次”“髌外上” “髌内上”，在施术部位定点、备皮消毒后，使用0.4 mm×40 mm 一次性无菌针刀进行松解。每7 天干预1 次，干预4 次。

1.5 观察指标和检测方法

1.5.1 Masoon 染色观察股直肌组织形态、胶原纤维含量及胶原容积分数改变。腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液（1 ml/kg）麻醉后耳缘静脉空气栓塞处死，取左膝髌上1～3 cm 股直肌，4%多聚甲醛中固定24 h 后常规脱水，包埋，切片，制片。采用Masoon 染色试剂盒对标本行常规染色，脱水，透明，封片。镜下观察、摄片，计算胶原容积分数（软件Image J，胶原容积分数=统一视野中胶原面积/所测视野面积）。

1.5.2 实时组织弹性成像检测股直肌弹性应变率比值评估股直肌组织硬度改变。麻醉后行左膝关节超声检测。使用日立彩超HI VISION Avius L 仪器，选取弹性成像模式，运用5～15 MHz 高频线阵探头于髌上2 cm股直肌正上方的长轴进行弹性成像。采用超声弹性成像分析软件计算股直肌的弹性应变率比值（弹性应变率比值=感兴趣点弹性应变值/皮下组织弹性应变值），反复测量3 次。弹性成像图以红色到蓝色表示组织从“软”到“硬”。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，比较使用两独立样本t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刀对KOA 兔股直肌弹性超声特征影响

空白组股直肌弹性成像呈绿色为主夹杂少许红色的低弹性图；模型组股直肌弹性成像呈蓝色为主的高弹性图；针刀组股直肌弹性成像呈蓝绿相间的中弹性图。与空白组比较，模型组股直肌弹性应变率比值升高（P ＜0.05）；与模型组比较，针刀组股直肌弹性应变率比值下降（P ＜0.05）。见图1。

图1 各组兔股直肌弹性超声成像结果比较

2.2 针刀对KOA 兔股直肌Masson 染色结果影响

空白组骨骼肌肌纤维均匀红染，排列整齐，无明显蓝色胶原纤维生成；模型组可见明显骨骼肌肌纤维破坏，肌纤维间隔增大，大量蓝染的胶原纤维沉积在骨骼肌肌纤维破坏处、新生肌细胞、肌间膜处，肌纤维化形成；针刀组可见散在骨骼肌肌纤维破坏，肌纤维间隔较模型组减小，骨骼肌肌纤维破坏处、新生肌细胞、肌间膜处有少量蓝染的胶原纤维沉积，纤维化程度减小。模型组股直肌胶原容积分数较空白组增加（P ＜0.05）；针刀组股直肌胶原容积分数较模型组减小（P ＜0.05）。见图1。

图2 各组兔股直肌Masson 染色结果比较（400×）

3 讨论

中医学认为，膝为筋之府，“筋束骨，骨张筋”，“骨正筋柔”调和状态可维持膝关节正常生理功能[9]。倘若筋骨平衡失调出现“筋出槽、骨错缝”病理状态，骨骼肌遭受累积性应力导致气血运行障碍，代谢产物堆积，形成粘连、瘢痕，产生疼痛和下肢功能障碍而发KOA[10]。针刀为中医原创技术，擅长松解粘连、瘢痕，疏通堵塞，调节病变软组织力学性能[11]，改善软骨力学结构[12]和免疫微环境[13]，延缓软骨退变[14]，从而有效改善KOA 疼痛和下肢功能障碍[15]。然而，其对骨骼肌慢性损伤修复的作用机制尚不明确。慢性骨骼肌损伤形成的粘连、瘢痕特征为组织硬度增加[16]，病理改变与骨骼肌纤维化相关[17]。实时组织弹性成像也能检测病灶区弹性变化评价治疗前后软组织硬度情况[18]，弹性应变率比值与组织硬度呈正相关，值越大说明组织硬度越高[19]。Masson 染色可以很好地反映骨骼肌纤维化程度[20]。因此，本研究凭借Masson 染色和超声弹性成像技术从股直肌组织硬度和纤维化角度探讨针刀治疗KOA 的作用机制。

本研究中，模型组股直肌弹性成像呈蓝色为主的高弹性图，模型组股直肌弹性应变率比值较空白组明显升高；且模型组股直肌可见明显骨骼肌细胞破坏，大量蓝染的胶原纤维填充在骨骼肌细胞破坏处，肌胶原纤维和胶原容积分数较空白组增加。提示改良Videman 法固定兔左后肢6 周可导致股直肌组织硬度增加和纤维化改变。相关研究表明持续异常机械应力可以介导骨骼肌细胞凋亡[21]，机体在自我修复过程中大量胶原纤维等细胞外基质沉积，导致组织硬度增加和严重骨骼肌纤维化[22]，与研究结果具有一致性。而针刀干预后股直肌弹性成像呈蓝绿相间的中弹性图针刀组股直肌弹性应变率比值、胶原纤维含量和胶原容积分数较模型组下降，提示针刀可以改善KOA 兔股直肌组织组织硬度和纤维化程度。既往研究表明，针刀减少骨骼肌细胞凋亡[23]，促进骨骼肌病理形态和功能修复[24-25]，这与本研究结果一致。

综上，针刀可以改善KOA 兔股直肌组织硬度，促进股直肌慢性损伤纤维化的修复，这可能是针刀治疗KOA 的力学效应机制之一。但本研究样本量较小，而且本研究超声设备无剪切波弹性成像功能，未能通过具体的弹性模型值对股直肌组织硬度进行定量评估，有待进一步大样本量实验和临床研究证实针刀对骨骼肌慢性损伤修复作用。